苏来金，赵 峰，马丽萍，周德庆

诺如病毒(Noroviruses, NoVs)属于杯状病毒科(Calicivirida)，诺如病毒属(Norovirus)，是一种重要的食源性病原菌，引发了许多传播与暴发[1-3]。NoVs可分为5个遗传组(genogroups, G)，分别被命名为GI到GVII，其中GI、GII和GIV感染人类[4-5]。贝类通过滤食作用可将诺如病毒持续富集在体内，成为NoVs传播的重要载体[6]，在贝类中经常污染到GI、GII 2种基因群的NoVs[7-10]，目前检测NoVs的分子生物学方法包括：RT-PCR[11]，巢式RT-PCR[12]，荧光定量RT-PCR[13]等方法，也有同时检测GI、GII NoVs的检测方法[14-16]，然而不同基因群的NoVs鉴定一般需要有多对引物分别检测，甚至还需要对扩增产物回收、测序鉴定、操作繁琐、耗时较长。

本研究通过对比分析GI、GII NoVs流行株的基因序列，筛选一对引物对GI、GII NoVs同时检测，根据Synergy brands(SYBR) Green I 荧光定量中熔解曲线特性[17-18]，建立了基于SYBR Green I荧光定量熔解曲线分析的快速分群方法，旨在为贝类中单基因群或混合型基因群NoVs的快速检测与分群分型提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1试验材料 6株阳性NoVs分别为57397毒株(GI.1型，GenBank:M87661.2)，54108毒株(GI.3型， GenBank: GQ856470.1), 55063毒株(GI.6型，GenBank: GQ856464.), 57395毒株(GII.4型，GenBank:KC752514),F278毒株(GII.12型，GenBank NO:JQ899442), GZ2013-L20毒株(GII.17型，KR869038)为中国疾病预防控制中心提供，为感染病人的粪便样品，经浓缩冷冻保存，基因型别均经过扩增测序后，使用美国CaliciNet诺如病毒在线分型工具(https://norovirus.phirearchlab.org/)进行分型确认；轮状病毒(Rotavirus，RV)、星状病毒(Astrovirus，AstV)为实验室保存的病毒cDNA，由青岛市疾控中心提供。用于人工污染的贝类样品为青岛城阳水产品批发市场采集的鲜活牡蛎，经过检测未发现NoVs检出。贝类检测样品为2015年1-12月从青岛城阳水产品批发市场采集的牡蛎、扇贝、毛蚶、菲律宾蛤仔、中国蛤等5种贝类，每月采集2次，全年共采集120份样品。

1.2设备与试剂 NanoPhotometerTM微量核酸蛋白测定仪，购自德国IMPLEN公司；罗氏Light Cycler® 2.0全自动荧光定量PCR仪，购自德国Roche公司；Sigma 1-14冷冻离心机，购自德国SIGMA公司；Biometra PCR仪，购自德国Biometra公司；DYCP-31E型电泳仪，购自北京六一仪器厂；凝胶成像系统，购自法国Vilber Lourmat公司； High Pure Viral RNA Kit 、蛋白酶K购自德国罗氏(Roche)公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等购自北京天根(TIANGEN)公司，DNaseI(RNase Free)、SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒等购于大连宝生物(TaKaRa)公司。

1.3引物筛选 从GenBank下载目前用于分群分型的主要毒株GI(GeneBank NO:M87661、L07418、AB447414、AB042808、KJ402295、AB081723、MH130046、AF538679、KF586507、M0127530)、GII(GeneBank NO. U07611、DQ366347、JQ751034、AB220924、AB220921、 AY032605、EF126965、HM802544、AB294779、AB933767、AB434770、JX459908、DQ078829、 AY682550、AB684664、JX846926、AB039780、AY038599、AB126320、 AJ277618、 JN899242、 GU017903、 AY502010、 LC037415、AY823304、 AY823306、 EU275779、 JN899245、AB233471、MG495080、MG495085、 GQ856469、 KU306738)NoVs的基因序列，利用DNA star进行序列比对，筛选GI、GII同时保守区域的引物，最终选择同时检测GI、GII NoVs的引物为：上游引物P290： 5′-GATTACTCCAGGTGGGAYTCMAC-3′(引物位置：4568-4 590),下游引物P289：5′-TGACGATTTCATCATCACCRTM-3′(引物位置：4865-4886),扩增片段大小319 bp。

1.4 实验方法

1.4.1病毒人工污染、回收、RNA提取 取2 g牡蛎消化道样品，加入10 μL的病毒原液，加入2 mL PBS缓冲液，匀浆2 min；NoVs回收按照实验室前期建立的方法[19]，RNA提取使用High Pure Viral RNA Kit(Roche)试剂盒说明方法进行。

1.4.2普通RT-PCR与荧光定量反应体系优化 cDNA合成扩增体系为50 μL，5 μL 10×Buffer，8 μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 10 mmol/L dNTPs，2 μL P289引物，0.7 μL 10 U/μL AMV-RT 反转录酶，0.2 μL 50 U/μL RNasin，2 μL病毒RNA模板，补足去离子水，42 ℃反应1 h。

PCR反应：5 μL 10×Buffer，4 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 10 mmol/L dNTPs，上下游引物各1 μL，0.5 μL 5 U/μL Taq酶，8 μL cDNA，补足去离子水，反应条件：94 ℃ 3 min，然后94℃ 1 min，49℃ 1 min 20 s，72℃ 1 min，40个循环，最后72 ℃ 10 min。产物电泳后经测序进行鉴定。

荧光定量的PCR采用20 μL的体系进行扩增，SYBR® premix Ex TaqTM II (2×) 15 μL，2条引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板100 ng左右，补足去离子水。荧光定量PCR扩增: 95 ℃预变性30 s，1个循环；然后95 ℃变性5 s，49 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35个循环。

1.4.3荧光定量标准品制备 使用GII.4型NoV的RNA为扩增对象，RT-PCR产物电泳切取特异性条带，用胶回收试剂盒回收后，根据实验室方法制备质粒[20]，并提取DNA，用生物分光光度计测定质粒DNA的浓度和纯度，换算成拷贝数，并进行梯度稀释，作为系列标准品进行方法建立。

1.4.4SYBR Green I荧光定量PCR的TM曲线 熔解曲线分析按照荧光定量试剂盒说明书中推荐的程序，以0.1℃/s变化速度从65℃升高至95℃绘制熔解曲线。

1.4.5特异性与准确性试验 使用GI.1、GI.3、GI.6、GII.4、GII.12、GII.17等6株阳性NoVs，以轮状病毒(RV)、星状病毒(AsTV)为阴性对照，以二次水为空白对照，对建立的方法进行验证，确定检测方法的特异性和准确性。

1.4.6稳定性与重复性 将不同型别的NoVs，人工污染贝类后，分3个时间批次利用荧光定量PCR熔解曲线法测定Tm值，然后，计算3个批次样品的Tm平均值、标准偏差、变异系数以及对Tm值进行方差分析，确定方法的稳定性和重复性。

1.4.7验证性试验 对采集的120个贝类样品，利用建立的方法，结合普通RT-PCR，对检测出的阳性NoVs，进行PCR扩增，片段回收、测序分析，与熔解曲线检测结果对比，验证方法的实用性。

1.5数据处理 所有实验重复3次，数据结果用平均值±标准误差表示，数据处理使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用LSD法进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。荧光定量标准曲线、扩增、熔解曲线使用罗氏Light Cycler® 2.0全自动荧光定量PCR仪自带软件自动生成。

2 结 果

2.1普通RT-PCR结果 使用P289和P290引物，对6株NoVs阳性样品进行普通RT-PCR扩增。由图1扩增产物电泳图可知：P289/P290引物可以特异性扩增GI和GII NoVs阳性毒株，不能扩增RV和AstV，说明引物特异性良好，RT-PCR扩增产物大小与预期319 bp相符，反应干扰少，说明扩增反应准确。

备注：从左到右M为DL2000 maker，1-2为 GI.1；3-4为GI.3；5-6为GI.6；7-8为GII.4；9-10为GII.12；11-12为GII.17；13-14为RV；15-16为AstV；17为空白对照图1 不同型别诺如病毒的普通RT-PCR结果Fig.1 RT-PCR results of different genotype NoVs

2.2荧光定量检测 从图2可以看出，在病毒标准品为102～109copies范围内，荧光定量扩增曲线具有良好的扩增，RV、AstV和空白对照均没有扩增，说明反应特异性良好；从图3可以看出，在病毒标准品为103～109copies范围内的标准曲线性关系良好(R2=0.993，P<0.01)，说明定量反应准确。

从左到右A-H分别为3.5×109，3.5×108，3.5×107，3.5×106，3.5×105，3.5×104，3.5×103，3.5×102 copies的诺如病毒质粒标准品，I，J，K分别为RV，AstV和空白对照图2 荧光定量反应扩增曲线Fig.2 Amplification curve of fluorescence quantitative reaction

从左到右A-G分别为3.5×109，3.5×108，3.5×107，3.5×106，3.5×105，3.5×104，3.5×103 copies的NoVs质粒标准品图3 荧光定量标准曲线Fig.3 Standard curve of fluorescence quantitative

2.3准确性和特异性 6株不同型别的NoVs阳性样品经过SYBR Green I法荧光定量PCR扩增后，进行熔解曲线分析。由图4可以看出，GI诺如病毒和GII诺如病毒扩增曲线可以明显区分，其中GI诺如病毒对应的Tm值在85 ℃左右，GII诺如病毒对应的Tm值在86 ℃左右，区分度明显，型别鉴别与实际样品型别相符，轮状病毒、星状病毒和空白对照均无扩增曲线，也无Tm值，说明反应特异性良好。6株不同型别的NoVs阳性样品的熔解曲线Tm值与区分度情况见表1。可以看出，GI诺如病毒的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.35，t2=0.59，t3=0.23,P>0.05)，GII诺如病毒的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.35，t2=0.18，t3=0.18,P>0.05)，GI诺如病毒的Tm值为85.15±0.02，GII诺如病毒的Tm值为86.06±0.01，两组基因群之间进行方差分析，差异有统计学意义(F=7507.60,P<0.05 )，因此，通过Tm值不能区分GI或GII同一基因群内的不同型别，但可以用来区分GI和GII基因群间的NoVs。

图4 不同型别诺如病毒的熔解曲线分析Fig.4 Analysis of dissolution curve of Norovirus different genotype NoVs

表1 不同型别诺如病毒Tm值分析
Tab.1 Analysis of Tm value of different genotype NoVs

基因型Tm 值GI.185.13±0.11aGI.385.15±0.08aGI.685.16±0.05aGII.486.07±0.04bGII.1286.05±0.06bGII.1786.06±0.05b

注：Tm值两两比较，同列数字后字母不同表示比较有统计学差异(P<0.05)，字母相同表示比较后无统计学差异(P>0.05)。

2.4方法的稳定性 将6株不同型别的阳性NoVs人工污染牡蛎后，分3个时间批次利用荧光定量PCR熔解曲线法测定Tm值，计算3个批次样品的Tm平均值、标准偏差、变异系数。从表2中可以看出，对3个检验批次NoVs的Tm值均没有较大变化，RSD均小于0.1%，GI和GII NoVs的Tm平均值方差分析，差异有统计学意义(F=2162.25,P<0.05)，GI.1组内不同批次的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.08，t2=0.40，t3=0.32,P<0.05)，GI.3组内不同批次的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.34，t2=1.80，t3=1.46,P<0.05)，GI.6组内不同批次的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.43，t2=0.22，t3=0.22,P<0.05)，GII.4组内不同批次的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.81，t2=2.00，t3=0.49,P<0.05), GII.12组内不同批次的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.10，t2=0.28，t3=0.38,P<0.05), GII.17组内不同批次的Tm值两两比较，差异无统计学意义(t1=0.59，t2=1.33，t3=0.74,P<0.05)，上述结果表明建立的鉴别方法稳定性强，具有良好的重现性。

2.5样品中诺如病毒检测与鉴定 对2015年1-12月采集的不同贝类样品中NoVs的检测，并利用本研究建立的方法、RT-PCR扩增后测序鉴定方法进行比较。从表3中可以看出，120份贝类样品中共有7个样品检出了NoVs阳性结果，检出率为5.83%，其中有2份样品(牡蛎和毛蚶)中出现了2个Tm值，说明这两份样品同时存在GI和GII NoVs，其他样品均出现1个Tm值，说明这些样品存在单一类型的NoVs。经过测序鉴定与本方法的结论进行比对，7个样品的判定结论均一致，说明本研究建立的方法适合贝类中GI和GII NoVs的快速检测与鉴定分群。

3 讨 论

国际上按照NoVs基因组聚合酶区和衣壳蛋白区的序列，将NoVs被分为5个基因组(Genogroups)[21]，其中GI和GII以及GIV NoVs感染人类[22-23]。根据NoVs的核苷酸序列，GI和GII NoVs可进一步分为8和17个基因型(Genetic Cluster 或Genotype)[24]。近年来，NoVs的基因重组和变异的不断出现，GI和GII NoVs 进一步分为9个和29个基因型。对几个NoVs全长基因组序列的分析表明，同一基因群内不同病毒株的核苷酸序列同源性为69%～97%，而不同基因群的病毒株核苷酸序列同源性只有51%～56%[25]，这为本研究利用核苷酸序列开展不同基因群间的快速鉴定奠定了基础。

贝类引起的NoVs疫情暴发中，有1个显著的特点是在感染者和受污染的贝类中可以检测出多个型别的NoVs，尽管针对混合基因型NoVs的多重检测方法已经建立[26-27]，但却无法快速分群分型，传统的分群分型方法仍然以基因扩增、测序、比对分析为主，耗时较长，尤其在贝类中NoVs含量低、型别复杂、存在样品成分干扰等情况下，NoVs快速检测和分群分型就显得尤为迫切。因此，如何快速地确定贝类中NoVs污染的基因群类别，对于追溯污染的贝类、发布NoVs疫情预警等具有重要的意义。本研究探索分析了目前流行的NoVs毒株及参考分群分型毒株的基因序列，筛选了可以同时检测GI、GII基因群的引物，建立了基于SYBR Green I 荧光定量检测及扩增熔解曲线分析方法，用阳性样品和实际贝类样品进行检测验证，均与测序方法得到的分型结果一致，该方法既可以实现定量检测，又可以快速分群，为贝类中NoVs快速检测和分群分型提供了技术支撑。

表2 不同检验批次诺如病毒的Tm值
Tab.2 Results of different test batches for Norovirus’ Tm

样品Tm值 GI.1GI.3GI.6GII.4GII.12GII.17A185.2385.0985.2286.0486.0386.08A285.1285.1285.0186.0386.0686.05A385.1585.1485.1986.0986.0586.13B185.0985.1185.0886.1186.0286.08B285.2185.0885.1286.0886.0586.09B385.1985.1985.1486.1286.0886.05C185.1385.1885.1986.0185.9886.04C285.1585.1685.1186.1386.0286.06C385.1785.1185.0886.2686.1186.07平均值85.16b85.13b85.13b86.10a86.04a86.07a标准差0.080.050.040.070.040.03相对标准偏差(%)0.090.050.050.080.040.03

注：A、B、C分别代表不同的检验批次，对不同型别NoVs的Tm值的平均值进行两两比较，同行数字后字母不同表示差异有统计学意义(P<0.05)，字母相同表示比较后差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 阳性样品的检测与基因群鉴定
Tab.3 Detection and genogroups identification of positive samples

月份样品Tm1 Tm2 本方法测序方法一致性1月牡蛎85.1486.09GI,GIIGI,GII是2月扇贝85.12-GIGI是2月牡蛎-86.07GIIGII是3月毛蚶85.1186.07GI,GIIGI,GII是11月菲律宾蛤仔-86.08GIIGII是12月牡蛎85.16-GIGI是12月扇贝-86.07GIIGII是

备注：-表示未检出。

利益冲突：无