王艳华，KHAN MUZ，许 笑，蔡建平

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种革兰氏阳性厌氧芽胞杆菌，广泛存在于自然界，尤其是在土壤、人类和动物的肠道中广泛存在。它可以感染人和各种动物(主要为牛、羊等)，造成人类食物中毒，引起动物坏死性肠炎、肠毒血症以及创伤性气性坏疽等疾病。这些病不仅严重威胁着人类和动物的健康，而且给社会造成了巨大的经济损失[1-3]。最近，依据产气荚膜梭菌产生的主要毒素和致病性的不同，将其修订为7个型(A至G型，见表1)[4]。在所有类型的产气荚膜梭菌中α-毒素(CPA)都是最保守的，其基因位于染色体上，编码β-、ε-、ι-、CPE和NetB毒素的基因位于质粒上[5]，A型菌株被认为是人类最易感染的病原体[6]。

表1 产气荚膜梭菌毒素型
Tab.1C.perfringenstoxin-based typing scheme

Toxinotype(toxin gene)a-toxin (plc or cpa) β-toxin(cpb) ε-toxin(etx)i-toxin(iap and ibp)CPE(cpe)NetB(netB)A+-----B+++---C++--+/--D+-+-+/--E+--++/--F+---+/--G+----+

注：+为indicates production of that toxin；- 为indicates no production of that toxin.

20世纪80年代以来，人们对产气荚膜梭菌的多种酶、毒素基因及其产物的功能以及它们与宿主的相互作用进行了深入研究。这些毒素和酶具有特定的活性，通常毒素和酶协同作用，从而使其在致宿主组织病变过程中发挥重要作用[7-9]。20世纪70年代，有人提出产气荚膜梭菌中存在调节毒素产生的特定机制[7,10]。之后，研究人员报道了一种小信号分子参与穿孔溶血素O产生的调节[11-12]。1994年产气荚膜梭菌双组分VirS/VirR调节系统得以鉴定，并认为毒素的产生受该系统严格调控[13-14]，例如，A型产气荚膜梭菌仅在芽胞形成过程中产生肠毒素(CPE)。此后，发现许多毒素基因受VirS/VirR双组分调控系统和辅助基因调节因子(agr)群体感应(QS)系统的调控。进一步研究发现几种双组分系统和RNA调节因子形成一个紧密的网络对毒素的产生进行调控[9]。因此，产气荚膜梭菌毒素产生和调控机制研究成为人们了解和阐明该病原菌致病性的一个最重要的方面。产气荚膜梭菌的几个双组分调控系统已经被广泛分析，本文主要就VirS/VirR系统对产气荚膜梭菌毒素的调控机制进行综述，以期能为今后该菌致病机理研究和抗菌药物的开发奠定新的起点。

1 双组分调控系统组成

双组分系统是细菌最关键的信号转导系统，可以感知环境并将信息传输至细胞中[15]。一个典型的双组分系统通常由位于膜的传感器组氨酸激酶和充当转录调节因子的细胞质反应调节子组成[16]。组氨酸激酶是细菌感应各种环境变化必需的，通常是由2个单体组成的同源二聚体膜蛋白，每个单体含有1个可变的传感器结构域(sensor domain) 和1个保守的传递器结构域(transmitter domain)，2个跨膜结构域通过1个α-螺旋相连。其传感器结构域能感应环境变化，并将信号传递到细胞质传递器催化结构区域。反应调节子控制输出信息，反应调节子是双组分信号转导系统中的第2个组分，含有1个或多个保守的 N 端接受器结构域(receiver domain) 和可变的 C 端效应器结构域 (effector domain)。组氨酸激酶的传感器结构区域能够检测到体内外刺激，调控组氨酸激酶的活性。组氨酸激酶催化 ATP 依赖的特定的组氨酸自主磷酸化，然后反应调控蛋白催化组氨酸的磷酸基团转移到它自身的天门冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化激活效应器结构域，从而产生一系列调控反应[17]。目前研究表明许多双组分系统含有额外的调节伴侣蛋白[18]。双组分系统信号的终止需通过反应调节子去磷酸化完成，在大多情况下，反应调节子的去磷酸化需要通过另一种蛋白-辅助磷酸酶的催化。双组分调节控系统可调节细菌的多种代谢过程、细菌细胞周期、细菌间的信号交流和细菌毒力因子的表达[19]。

产气荚膜梭菌VirS/VirR系统中的virR和virS基因位于操纵子中，被转录为单个的2.1 Kb mRNA[20]。VirR/VirS系统是产气荚膜梭菌最重要和最有特点的1个双组分系统。VirS/VirR系统由传感器组氨酸激酶virS基因和反应调节因子virR基因组成。virS基因产物VirS在N末端具有6个假定的跨膜结构域。C末端结构域包含传感器组氨酸激酶中常见4个基序中的3个。这些基序包括His-255残基是其它传感器激酶中自磷酸化位点[14]。virR的N-末端结构域含有保守的天冬氨酸残基，其接受来自同源传感器组氨酸激酶的磷酸基团[13-14]。

2 双组分调控系统调控机制

2.1VirS/VirR系统对毒素的调控 VirR/VirS系统最早于1994年被鉴定为α-毒素基因plc，κ-毒素基因colA和θ-毒素基因pfoA的调节因子[13,20]。Northern分析显示，3种毒素基因plc，pfoA和colA在转录水平受到VirR/VirS的正调控。VirS/VirR系统调节3种毒素基因的模式不同。pfoA基因具有2个启动子，主要和次要启动子，其中只有主要启动子依赖于VirR/VirS。colA基因含有7个转录起始位点，其中2个依赖于VirR/VirS。plc基因仅具有1个启动子，其由VirR/VirS部分调节[20]。由于在3种毒素基因的启动子区域中未发现类似的结构，因此表明VirR/VirS系统不直接调节所有这些毒素基因的表达，并且在VirR/VirS调节网络中存在更复杂的系统，可能涉及其他二级调节因子[20]。

之后研究发现，VR-RNA就是上述调控系统的1个二级调节因子。通过VR-RNA，VirS/VirR-VR-RNA级联反应调控各种基因的表达[21]。因此，VirS/VirR系统是一种全局的基因调节因子，也是产气荚膜梭菌最重要的调节因子之一。

除α-毒素基因外，产气荚膜梭菌的主要毒素基因都位于质粒上。VirS/VirR系统虽位于染色体上，但它可以调节染色体和质粒上的基因。例如，A型产气荚膜梭菌菌株13中质粒上的胶原粘附素基因(cna)和β-2毒素基因(cpb2)都受VirS/VirR系统调节。cna受该体系负调控，cpb2受正调控[22]。

cpb编码产气荚膜梭菌β毒素(CPB)，它是由B型和C型菌株产生的主要毒素，其引起出血性坏死性肠炎。据报道，C型菌株产生的CPB受VirS/VirR系统调控[23]。CPB是C型菌株必需的肠道毒力因子[24]。VirS/VirR通过调节CPB的产生致使C型菌株致病[23]。VirS/VirR系统是控制染色体和质粒上基因的关键调节因子。

VirS/VirR系统还可通过调节蛋白水解所需的蛋白酶活性来调节iota毒素的活性。Iota毒素是E型产气荚膜梭菌产生的主要毒素。Iota毒素以无活性形式产生，需要蛋白酶的水解来激活。据报道，未成熟蛋白的裂解是由VirS/VirR依赖性蛋白酶来完成的[25]。

2.2VirS/VirR系统对其它基因的调控 VirS/VirR系统不但调节毒素基因，还对其它基因进行调节。研究人员通过差异显示法对VirS/VirR调节的基因进行了鉴定，鉴定到3个克隆。通过核苷酸测序和Northern杂交实验证实：1个质粒上的metB(胱硫醚γ-合成酶)，cysK(半胱氨酸合酶)和ygaG(假设蛋白)基因受负调控，而第2个质粒上的ptp(蛋白酪氨酸磷酸酶)和cpd(2′， 3′-环核苷酸2′-磷酸二酯酶)基因显示受VirR/VirS系统的正调节。第3个质粒上的hyp7基因受到VirR/VirS系统的正调控，hyp7可激活产气荚膜梭菌中colA和plc基因的转录，但不激活pfoA基因的转录。这些结果表明，全局调节系统VirR/VirS可以正向和负向调节毒素基因以外的各种基因，并且hypl基因可能编码产气荚膜梭菌毒素新的调节因子[26]。

据报道，VirS/VirR系统能感知细胞[27]：C型产气荚膜梭菌与Caco-2细胞接触，产气荚膜梭菌会迅速上调毒素表达，而VirR突变体即使与菌株相同类型的细胞接触也不能诱导毒素产生。这些数据表明，VirS/VirR系统对于感知环境(特别是环境中的细胞)和上调毒素产生是非常重要的[27]。

基因组分析表明产气荚膜梭菌缺少参与氨基酸生物合成相关的基因[8]，因此，产气荚膜梭菌在宿主体内生长，必需降解宿主组织并将产生的营养物质快速转运到细菌细胞中。产气荚膜梭菌的这种能力对于其在宿主中存活和生长是必不可少的，因此，它会依据不同环境来上调毒素及酶的产生。当产气荚膜梭菌识别宿主细胞并准备降解宿主细胞时，通过与Caco-2细胞接触而导致的毒素上调很明显是其中的一种反应[28]，但尚不知道产气荚膜梭菌是如何识别Caco-2细胞的。

2.3VirS/VirR和QS信号合成系统 双组分系统毒力相关基因的表达受QS调控，该系统由QS信号合成系统和VirS/VirR双组分系统组成。最近发现pfoA基因在细菌的对数生长中期短暂表达；此后，它的表达被迅速关闭，这表明存在一个自群体淬火(self-quorum quenching, sQQ)系统。添加静止期培养上清液可诱导该sQQ系统发挥作用。sQQ系统是一种小分子物质，具有热稳定性，可通过超滤膜过滤筛选。此外，sQQ系统也可由浓度上与静止期培养物相同的纯乙酸和丁酸诱导，表明产气荚膜梭菌产生的有机酸参与sQQ系统。在控制pH的分批培养物中，sQQ系统明显减弱；pfoA的表达延长至对数生长后期，最终增加了1个数量级。此外，与上述有机酸相同pH条件下，盐酸也可诱导sQQ系统发挥作用，静止期培养上清液会抑制VirS/VirR调控的基因表达。总的来说，产气荚膜梭菌的毒力因子的表达受到sQQ系统的下调，而sQQ系统是由主要酸性代谢物和酸性环境介导的，这表明采用控制pH将成为抵抗细菌毒力的一种新策略[29]。

Singh等[30]对靶定VirS/VirR双组分系统的QQ肽进行了研究。根据构效关系分析结果他们设计了2种不同的类型QQ肽，这2种类型的肽在微摩尔浓度水平时会抑制pfoA的转录。利用QQ化疗法有望治疗由产气荚膜梭菌引起的传染病，如气坏疽和坏死性肠炎。

3 VirR结合位点的鉴定

为了深入研究VirS/VirR的调节机制，鉴定VirR结合位点是一项重要工作。对pfoA启动子区域的分析显示在该区域中存在不完全的直接重复序列CCCAGTTNTNCAC[31]。使用定点诱变，DNase I足迹分析和凝胶移位分析显示该序列为VirR结合基序，这些序列被指定为VirR框[32]。VirR能独立地结合到位于pfoA基因上游的2个VirR框。此外，这些VirR框之间的距离和它们与pfoA启动子的35区的距离对于VirR介导的激活作用是相当重要的。

研究人员对产气荚膜梭菌菌株13基因组序列VirR框基序搜索发现，只有5个基因在其启动子区域具有VirR结合位点，包括pfoA和编码VR-RNA的vrr基因[8]。其它3个基因是ccp基因(它编码半胱氨酸蛋白酶，a-clostripain)和2个假定基因virT和virU[7]，virT和virU两者都编码RNA调节分子[33]。已经证明这5个基因的VirR框都是功能性的[33]，VirR激活这5个基因的转录。

virT基因紧挨着ccp基因。对virT突变体及其互补衍生物进行分析表明，VirT RNA在转录水平上负调节pfoA和ccp[33]。不是所有已知序列的产气荚膜梭菌菌株中都存在virT基因，它仅存在菌株13和ATCC3626中[34]。VirU的过表达可激活pfoA，ccp，vrr和virT的转录[33]。这两种RNA调节子的调节水平并不强烈，它们对由VirS/VirR调控的基因的表达进行微调。

研究发现ATCC13124中的2个VirR框，SM101中的1个VirR框都与VirR结合[35]。这些基因大多数编码假定蛋白质，但其中一些可能编码调节性RNA分子，如VirT和VirU。研究还在位于质粒上的毒素基因启动子区域发现了VirR框。例如，发现编码产气荚膜梭菌成孔毒素NetB基因上游具有VirR框。NetB的产生受VirS/VirR系统的调节，并且VirR与netB基因上游的VirR框结合[36]。在菌株JFP718中netE和netG毒素基因上游也存在VirR框[37]，它们的功能尚不清楚。NetB是禽类坏死性肠炎的关键毒力因子[38]。因此，VirS/VirR系统通过控制不同菌株中不同毒素的产生来控制不同致病力菌株的毒力。

4 展 望

随着细菌基因组序列的公布，运用生物信息学的方法和系统性突变的方法己经成功鉴定几种产气荚膜梭菌毒素和酶的调控系统，并对其功能进行了研究。但是与其它致病菌相比，我们对该菌的毒力调节机制知之甚少。对艰难梭菌和肉毒杆菌的研究发现某些氨基酸、特定氨基酸混合物、葡萄糖和σ因子影响或抑制某些细菌毒素的产生[38-40]。产气荚膜梭菌中也可能存在类似的毒素调控机制。因此，我们需要对产气荚膜梭菌毒力调节机制进行更广泛深入的研究，详尽阐明毒力相关基因的调节网络，为开发新型抗菌制剂提供新的靶点，进而全面地抵抗产气荚膜梭菌感染。

利益冲突：无