王雪飞 ， 任洪艳 *，阮文权 ， 徐 倩

（1.江南大学 环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122；2.江苏省厌氧生物技术重点实验室，江苏 无锡214122）

微藻细胞富含蛋白质、脂质和多糖等，在食品、医药以及化工等方面应用越来越广泛[1-4]。螺旋藻是一种多细胞丝状蓝藻（Blue Green Algae），又称蓝细菌（Cyanobacteria），是微藻培养的典型藻种，具有生长速度快、不易被污染、营养物质丰富等特点[5]。

限制微藻大规模工业化利用的主要因素是藻产品成本较高，尤其是在微藻培养和采收方面[6-7]。微藻培养过程中，营养盐成本占微藻培养成本比重很大，其中碳源、氮源及磷源成本占微藻培养总成本的20%～30%[8]；同时，微藻培养需要消耗大量的水资源。此外，藻细胞的采收问题也是限制微藻技术商业化应用的瓶颈之一。采收过程中存在微藻生物量偏低、藻水分离难度大、藻细胞不易收获等技术问题[9]，这与微藻细胞微小、带负电荷、在水中处于稳定的悬浮状态、很难通过重力沉降实现固液分离[10]有关。因此，降低微藻培养过程中营养盐和水资源消耗，寻求高效率的微藻分离采收技术是当前亟需解决的问题。

目前微藻培养系统的两种主要类型是开放式跑道池和封闭式光生物反应器（photobioreactor，PBR）[11]。传统的PBR没有固液分离功能，反应器中的水力停留时间 （hydraulic retention time，HRT）和微藻停留时间（microalgae retention time，MRT）是相同的，获得的生物质浓度较低，给后续采收过程带来很大的难度。为解决这个问题，可在膜光生物反应器（membrane photobioreactor，MPBR）模式下培养微藻。MPBR是微藻培养和采收的一种全新的方法，它将光生物反应器同过滤器相耦合，进而将HRT和MRT分开，实现固液分离[12]。且膜过滤操作简单，在微藻培养和采收方面的应用越来越多，Su[13]等人在MPBR中利用电厂污水培养栅藻；Bilad[14]等人利用浸没式微滤膜采收微藻生物质；同时MPBR中过滤液可以再循环用作微藻培养液[15]。此外通过膜的过滤作用，提高藻产品生物量浓度，在采收过程中无需使用助凝剂和絮凝剂等化学药品。

作者选取钝顶螺旋藻作为培养对象，在PBR和MPBR中进行培养和预采收，考察不同初始藻密度和稀释率下螺旋藻的生长及其对营养盐消耗利用情况，比较得出MPBR在提高藻产品质量浓度，节约水资源，节约营养盐等方面的有效性，为规模化高密度培养和预采收微藻提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

藻种：采用钝顶螺旋藻，编号FACHB-901，购自中科院水生生物研究所淡水藻种库。

培养基：采用的改良的Zarrouk培养基配方[16]，见表 1、表 2。

表1 改良的Zarrouk培养基Table 1 Modified Zarrouk medium

表2 微量元素储备液A5Table 2 Trace element stock solution A5

1.2 实验装置

采用光生物反应器（PBR）作为钝顶螺旋藻的培养容器，实验装置见图1。反应器为中空柱体，由有机玻璃制成，壁厚6 mm，内径144 mm，总高575 mm，有效容积为7.4 L，微藻培养时放置于GXZ-380B光照培养箱中。

膜光生物反应器（MPBR）实验装置见图2。膜组件为PVDF微滤膜，孔径1 μm，膜面积为0.025 m2。将膜组件放入过滤槽中，一端与蠕动泵相连，对藻液进行抽滤、浓缩。

1.3 实验设置

考察钝顶螺旋藻在PBR中生物量的变化，将培养至对数期的藻种接入PBR中，使其初始光密度值约为 0.5，于光强 3 000 Lux、温度（30±1） ℃、光周期16/8（day/night）条件下培养。在培养期间利用空气泵以曝气的方式向PBR中不间断通入空气，气速为1.63 L/min，气体流量采用转子流量计控制。每天测培养初始和结束时测定硝态氮、磷酸盐和溶解性无机碳浓度等指标，初步确定微藻在PBR中生物量变化和营养盐消耗情况，为后期实验选取合适的生物量进行培养和采收提供参考。实验设置3组平行样，结果取平均值。

图1 光生物反应器实验装置Fig.1 Schematic illustration of PBR

图2 膜光生物反应器实验装置Fig.2 Schematic illustration of MPBR

考察PBR中不同稀释率和生物量对钝顶螺旋藻生长和预采收的影响，根据初步确定的钝顶螺旋藻在PBR中生物量的变化情况，选择不同生长时期的螺旋藻进行研究。实验采用半连续操作，稀释率分别选取D＝0.05、0.08、0.10、0.13 d-1。每天采收一定体积的藻液作为藻产品，同时加入相同体积的Zarrouk培养基，维持PBR中藻液体积不变，不同稀释率下每天采收藻液和补加Zarrouk培养基的体积见表3。每天测定采收藻产品的OD560值。光强、温度等培养条件同上。实验设置3组平行样，结果取平均值。

表3 不同稀释率下PBR中每天采收藻液和补加Zarrouk培养基的体积Table 3 Volumes of harvesting algae suspension and Zarrouk medium during different dilution rates in PBR every day

考察利用MPBR培养和预采收钝顶螺旋藻，根据PBR实验结果，选择合适的生物量进行实验。将膜组件安装在过滤槽中，利用蠕动泵将反应器中藻液抽至过滤槽中，通过膜组件对其进行过滤浓缩。蠕动泵转速设置为100 r/min，每5分钟测量抽得的过滤液体积，过滤槽中浓藻液体积，计算膜通量和体积浓缩系数，确定一定藻质量浓度下适宜的体积浓缩系数。MPBR不同稀释率对螺旋藻生长和预采收的影响实验中，采用半连续操作，稀释率分别选取D＝0.08、0.10、0.13 d-1。 通过膜组件的过滤作用，实现藻液浓缩得到藻产品，同时将过滤液循环至光生物反应器中重复利用。每天对藻产品进行采收，同时利用一定体积的去离子水代替Zarrouk培养基补加至光生物反应器中，维持反应器中藻液体积不变，不同稀释率下每天采收藻液、过滤液，藻产品和补加去离子水的体积见表4。每天测定反应器中藻液、藻产品OD560值，计算得生物量质量浓度；培养初始每天取藻液30 mL，测定培养初始和结束时反应器中藻液pH值、硝态氮和磷酸盐浓度。光强、温度等培养条件同上。 实验设置3组平行样，结果取平均值。

1.4 指标测定及计算方法

生物量质量浓度：通过已知干质量钝顶螺旋藻液在560 nm下的光密度值，做生物量质量浓度与OD560的相关性曲线，通过每天测定螺旋藻液OD560，计算生物量质量浓度[17]。

pH值：使用Delta 320型数字式酸度计（Mettler-Toledo，德国）测定。

硝态氮质量浓度：采用紫外分光光度法测定[18]。

磷酸盐质量浓度：采用钼锑抗分光光度法测定[18]。

表4 不同稀释率下MPBR中每天采收藻液、获得过滤液，藻产品体积和补加去离子水的体积Table 4 Volumes ofharvesting algae suspension，penetrant，algae product and added deionized water every day during different dilution rates in MPBR

溶解性无机碳浓度：采用酸碱指示剂滴定法[19]。

稀释率：每天加入至反应器中Zarrouk培养基的体积与反应器中培养基总体积之比即为稀释率（dilution rate，D），计算公式：

式中：D为稀释率（d-1）；Vin为PBR中每天加入新鲜Zarrouk培养基的体积 （L/d）；V为PBR中培养基总体积（7.4 L）。

膜通量：

式中：J为膜通量（L/（m2·min））；Q为流量（L/min）；A为膜表面积（m2）。

体积浓缩系数：

式中：υ为体积浓缩系数；Fin为加入至过滤槽中藻液体积（L）；Fretentate为过滤槽中剩余藻液体积（L）。

2 结果与分析

2.1 PBR中钝顶螺旋藻的生长情况

考察钝顶螺旋藻在PBR中的生物量变化，结果见图3（a）。随着培养时间的进行，藻密度逐渐增大，第1～10天螺旋藻生长较快，生物量达到1.837 g/L；培养至第16天，生物量稳定在2.122 g/L左右；从3（b）中可以看出，随着螺旋藻的生长，pH值从初始9.14升高至9.88，在螺旋藻生长的适合范围内[20]。为维持PBR中适宜的藻浓度，保证较高生物量质量浓度下螺旋藻的快速生长，提高生物量产率，同时避免PBR中藻质量浓度太高而产生光遮蔽现象，根据生长曲线知，螺旋藻在第7～10天生长较快，生物量较高，所以选择螺旋藻生物量质量浓度在1.5～1.8 g/L范围内进行后续实验。

图3 钝顶螺旋藻在PBR中生物量和pH变化Fig.3 Changes of Spirulina platensis biomass concentration and pH in PBR

分析培养始末培养液的营养盐浓度，结果见表5。经过16 d的培养，HCO3-和NO3--N浓度明显减小，分别减少了83.13 mmol/L和124.34 mg/L，表明藻类利用HCO3-和NO3--N作为生长的碳源和氮源；CO32-浓度从初始30.60 mmol/L升高至77.75 mmol/L；培养过程中HCO3-浓度减少，CO32-浓度升高的原因是在水溶液中无机碳以 CO2、HCO3-、CO32-这3种碳源形式存在，三者存在相互转化的动态平衡：

Zarrouk培养基中采用碳酸氢钠作为无机碳源，主要以HCO3-形式存在，此时微藻同化来自HCO3-中的CO2，当CO2被利用后，再不断从HCO3-中重新释出CO2，使得上述平衡向左移动[20]。PO43--P浓度变化不大，分析磷源利用较少的原因可能是需要磷元素参与合成的核酸，ATP等含磷化合物在藻细胞中的含量较低[8]。同时发现培养结束时培养液中仍有一定浓度的HCO3-，NO3--N以及PO43--P剩余，表明初始添加量完全可以满足藻体的生长需要，因此基于成本考虑，可适当减少Zarrouk培养基中营养盐浓度。

2.2 PBR中不同稀释率和生物量质量浓度对钝顶螺旋藻生长和采收的影响

当PBR中螺旋藻生物量质量浓度达到1.540 g/L时，进行不同稀释率对螺旋藻生长和采收的影响实验，结果见图 4。当D＝0.05 d-1和D＝0.08 d-1时，PBR中螺旋藻生物量能够保持稳定，即采收一定藻液后，一天时间内PBR中螺旋藻生物量质量浓度能够恢复到初始值1.540 g/L左右；当稀释率增大到0.10 d-1时，PBR中生物量质量浓度开始出现下降；当D＝0.13 d-1时，藻产品生物量质量浓度明显下降，至1.270 g/L，PBR中出现明显的冲刷现象，表明在一定时间内，采收的生物量大于反应器中微藻的增殖量，导致反应器中生物量质量浓度不断降低，无法稳定运行。据此得到螺旋藻初始生物量质量浓度为1.540 g/L，最佳稀释率为0.08 d-1。

表5 培养初始和结束时营养盐浓度变化Table 5 Changes of nutrient concentrations in medium at the initial and final of cultivation

为进一步增加螺旋藻的生物量产率，考察PBR中螺旋藻生物量质量浓度为1.802 g/L时稀释率为D＝0.05、0.08、0.10、0.13 d-1时的螺旋藻的生长情况，结果见图 4。 当D＝0.05 d-1和D＝0.08 d-1时，PBR 中螺旋藻的生物量质量浓度能够稳定在1.8 g/L左右，表明此时较高的藻质量浓度下，并未产生明显的光遮蔽而影响螺旋藻生长速率；当D增大到0.10 d-1和0.13 d-1时，PBR中生物量质量浓度逐渐下降，出现冲刷现象，导致反应器中生物量质量浓度不断降低。因此，螺旋藻初始生物量质量浓度为1.802 g/L时，PBR的最佳稀释率为0.08 d-1。为提高螺旋藻的采收量，选择螺旋藻初始生物量质量浓度为1.8 g/L左右进行后续MPBR的相关实验。

2.3 MPBR中培养和预采收钝顶螺旋藻

2.3.1 体积浓缩系数的确定MPBR中利用膜组件对藻液进行过滤，浓缩时，增大藻液的体积浓缩系数可提高藻产品生物量浓度，但体积浓缩系数太高会加重膜污染，因此需选择合适的体积浓缩系数。藻液质量浓度为1.855 g/L时，于过滤槽中进行实验，结果见图5。随着体积浓缩系数的增大，藻液质量浓度变大，膜通量逐渐降低；第30分钟时藻液体积浓缩系数达到2.082，此时膜通量由初始值3.803 L/（m2·min） 下 降 至 2.970 L/（m2·min）， 下 降 了21.92%。在膜组件使用过程中，为保持较高的膜通量水平，提高膜的使用寿命，防止膜污染加重对膜造成损坏以及增加运行成本，在一定压力下，当膜通量下降20%左右时，需进行膜清洗[22]。因此，利用PVDF膜组件过滤，浓缩生物量质量浓度约为1.8 g/L的藻液时，体积浓缩系数最大为2，可最大程度浓缩藻液。

图4 初始生物量质量浓度为1.540 g/L和1.802 g/L时藻产品生物量质量浓度随稀释率的变化Fig.4 Changes of algae product biomass concentration during different dilution rates with 1.540 g/L and 1.802 g/L initial biomass concentrations

图5 膜通量和藻液体积浓缩系数的变化Fig.5 Changesofmembraneflux and volumetric concentration factor

2.3.2 MPBR中不同稀释率对钝顶螺旋藻生长和预采收的影响选择体积浓缩系数为2，初始藻液质量浓度为1.828 g/L进行MPBR中不同稀释率对螺旋藻生长和预采收的实验研究。不同稀释率下钝顶螺旋藻生物量质量浓度和pH变化见图6。从图6（a）可以看出，D＝0.08 d-1时反应器中螺旋藻生物量质量浓度稳定在1.820 g/L左右；D＝0.10 d-1时生物量质量浓度开始下降，开始出现冲刷现象；当D增大到0.13 d-1时生物量质量浓度持续下降，出现了明显的冲刷现象，导致反应器中生物量质量浓度不断降低。因此，确定MPBR的最佳稀释率为0.08 d-1。此外，膜组件的过滤作用使藻产品生物量质量浓度明显提高，最高可达3.319 g/L。本实验中体积浓缩系数约为2，与Bilad[15]文献报道中体积浓缩系数为4.4有一定差异，可能与膜组件，藻种等条件有关。因此，为进一步增大体积浓缩系数，后期长期连续实验中考虑改进过滤槽结构，合理选择膜组件材质、孔径、结构等条件；同时进行减缓膜污染的相关研究，提高膜的使用寿命，进而明显减少后续采收过程的能耗和成本。培养过程中MPBR中藻液pH变化见图6（b）。螺旋藻生长过程中pH不断上升，波动范围为9.4～9.8，与图2（b）中pH变化趋势相似，均在螺旋藻生长的适合范围内[20]。

在培养过程中对培养液中的氮磷进行了监测，氮磷质量浓度变化见图7。研究发现，氮磷质量浓度均随着培养时间的进行而下降，分别从初始的297.338、75.945 mg/L 分别减少至 198.908、55.105 mg/L。分析原因可能有两个：一是螺旋藻对营养盐的吸收利用作用；二是因为每天采收一定体积的藻液，同时加入去离子水，其稀释作用使得培养液中离子浓度不断下降。在第7天实验结束时，培养液中均剩余一定量氮磷营养盐，pH值也在螺旋藻生长的适合范围内，表明实验中培养液中氮磷质量浓度能够满足螺旋藻的生长需求，加入的去离子水并未对螺旋藻的生长产生不良影响。由此可见，一定时间内可以用一定体积的去离子水代替Zarrouk培养基补加到光生物反应器中，节约营养盐，降低螺旋藻培养成本。但在长期实验中，向Zarrouk培养基中加入去离子水的量要控制在保证营养盐满足螺旋藻生长需求的范围内。

MPBR中可将浓缩藻液过程中获得的过滤液循环至光生物反应器中重复利用，减少微藻培养过程中营养盐和水资源的消耗量，降低培养成本。最佳稀释率D＝0.08 d-1条件下，每天培养结束采收藻液后，MPBR中需补加296 mL过滤液和296 mL去离子水 （忽略培养初始时取藻液30 mL），PBR中需补加592 mL Zarrouk培养基；由此可见，与PBR相比，MPBR每天节约水资源、氮、磷营养盐的使用量分别为 296 mL 水、1.48 g NaNO3、0.296 g K2HPO4；MPBR中生物质平均采收量0.983 g/d，即获得1 g生物量，MPBR中可节约水、氮、磷的量分别为0.301 L、0.248 g、0.053 g。此外，在后续实验长期连续运行后，水资源和营养盐的消耗量会进行具体的核算。

图6 MPBR中不同稀释率下钝顶螺旋藻生物量和pH变化Fig.6 Changes of Spirulina platensis biomass concentration and pH during different dilution rates in MPBR

图7 培养开始和结束时藻液中氮磷变化Fig.7 Changes of nitrogen and phosphorus in medium at the initial and final of culturing

Livansky等[23]研究发现培养基循环利用会导致斜生栅藻生物量产率降低，微藻自身代谢物的积累会限制微藻的生长；可能是由于藻细胞对矿质营养盐有离子选择性吸收的特性[8]，尤其是在长期、大量的循环利用过滤液时，过滤液中非限制性营养物质的积累可能会抑制微藻的生长[15]；同时微藻在生长过程中或者细胞溶解时释放的某些代谢物（例如脂类、多糖、蛋白质等）[24-25]也会对微藻产生抑制作用[26]。但在本实验中，过滤液循环使用没有对微藻的生长产生不利影响，一方面可能是因为实验时间较短，且每天补加去离子水对非限制性营养物质的积累起到一定的稀释作用；另一方面是因为本实验培养液中生物量质量浓度在2 g/L以下（Livansky[23]研究中斜生栅藻生物量达到了3 g/L），微藻培养液中非限制性营养物质以及藻细胞自身代谢产物等积累量很低，不足以对微藻的生长产生抑制作用。

3 结 语

基于PBR和MPBR培养和预采收钝顶螺旋藻，确定了不同初始生物量质量浓度和稀释率对螺旋藻生长和预采收的影响以及MPBR在提高藻产品质量浓度，节约水资源，节约营养盐等方面的有效性。初始生物量质量浓度约为1.8 g/L时进行螺旋藻采收；与PBR相比，稀释率为0.08 d-1时获得1 g生物量，MPBR中可节约水、氮、磷的量分别为0.301 L、0.248 g、0.053 g。实验结果表明，膜组件的加入可完全截留藻细胞，实现微藻培养和采收过程中的固液分离，提高藻产品质量浓度，减轻微藻采收过程中后续脱水的能耗和成本；同时循环利用过滤液，节约水资源节约营养盐，降低了微藻培养成本。