许中霞，刘桂智，刘卫东， 郭瑞庭，李华钟*， 郑迎迎

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.中国科学院 天津工业生物技术研究所，天津300308）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一类由镰刀菌属真菌产生的类雌激素毒素，是目前全球污染最严重的三种霉菌毒素之一。ZEN主要存在于玉米、小麦、大麦和黍等农作物及其制品中，能导致摄入者出现早熟、生殖周期紊乱等雌激素紊乱症，给种植业和养殖业带来巨大损失[1-3]。ZEN还具有强致癌性，能够引起乳腺癌、食管癌等疾病[4-5]。为减轻霉菌毒素造成的饲料业和畜牧业的损失，人们陆续开发出多种物理、化学和生物学的方法来降解或吸附饲料中的霉菌毒素。化学法和物理法脱毒通常缺乏选择性，造成饲料中其它营养成分的破坏和流失。而生物酶法脱毒因其高选择性、脱毒彻底、操作简易，受到广泛关注。

Naoko Takahashi-Ando等[6]首次从粉红粘帚菌中分离出了一种可降解玉米赤霉烯酮的内酯水解酶ZHD101。ZHD101是目前研究最为广泛的玉米赤霉烯酮降解酶，其在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达产物可以高效的降解ZEN[7]，另外，zhd101转基因水稻和转基因玉米的种子也可以有效降解ZEN[8-9]，表明ZHD101具备良好的降解玉米赤霉烯酮的能力和巨大的应用前景。Takahashi-Ando等[10]通过对ZHD101的酶学性质表征，发现ZHD101的热稳定性较差，在50℃下迅速失活。较低的热稳定性使其无法满足饲料工业中制粒工艺的温度需求，为促进ZHD101在饲料工业中的应用，需要通过分子改造等手段提高其热稳定性。

在结构中引入二硫键是提高酶的热稳定性的常用手段[11-14]，二硫键通过降低蛋白解折叠状态的主链熵值和降低解折叠速度来稳定蛋白结构[15-16]。温度因子（temperature factor，B factor）是表征氨基酸残基摆动度的重要结构参数，温度因子越高，氨基酸所在部位的构象就越不稳定，相应的蛋白质热稳定性就越差。在温度因子高的蛋白质结构部位处引入二硫键，可以有效降低该部位的摆动度，从而提高蛋白质的热稳定性。

我们在前期研究中曾解析出ZHD101与底物ZEN的复合物分子结构[17]。在此基础上，作者进行基于结构的理性设计和分子改造，在蛋白质结构中温度因子较高的部位引入二硫键以提高ZHD101的热稳定性。我们选择了7对残基进行半胱氨酸突变以形成潜在的二硫键，进而构建四突变考察对热稳定性的影响。最后，对热稳定性提高的突变体进行分析，分析二硫键形成的可能性和对稳定结构的分子基础。本研究将对ZHD101在饲料工业的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒pET-46 EK/LIC-ZHD101：由台湾大学生物科技研究所刘嚞睿教授课题组构建。

1.1.2 试剂LB培养基：购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；Phusion高保真DNA聚合酶：购自Thermo Science公司；Dpn I酶：购自Fermentas公司；咪唑：购自Merck公司；PCR产物纯化试剂盒：购自康维世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器PCR仪：购自德国Eppendorf公司；AKTA purifier纯化系统：购自美国GE公司；高效液相色谱仪：购自安捷伦科技有限公司；Ultimate XB C18 Column：购自月旭科技上海有限公司；BCA试剂盒：购自康维世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 突变体构建我们前期工作中解析了ZHD101 的分子结构（PDB ID：3wzm），发现其结构中存在两处B factor明显较高的部位。我们在这两个区域中引入七对半胱氨酸双突变：A110C/P196C、S136C/R189C、D143C/P181C、S147C/P181C、D199C/A202C、L200C/A231C、R204C/G205C，以形成潜在的二硫键，研究其对热稳定性的影响。所采用的定点突变正向引物见表1。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in the study

定点突变采用QuikChange定点突变试剂盒进行。PCR产物转化大肠感受态DH5ɑ，挑取单克隆送至华大基因测序。测序突变正确的克隆提取质粒转大肠表达菌株BL21（DE3）中，进行后续表达实验。

1.2.2 ZHD101突变体的表达与纯化挑取单菌落于5 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的小试管中，37℃、220 r/min培养4 h。菌体生长至OD 600值达0.6～0.8时，转接1%至100 mL的LB培养基，37℃、220 r/min培养6 h。转接1%至3 L的 LB大瓶，37℃、220 r/min培养4 h，降温至16℃，加诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L，诱导24 h后离心收集菌体。将诱导表达的菌体用25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑、pH 7.5 的缓冲液重悬，经高压破碎机破碎，离心后的上清液为蛋白粗酶液。将粗酶液分别用Ni-NTA亲核层析柱和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂进行纯化。纯化产物透析在 25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、pH 7.5的缓冲液中，并用Amicon Ultra-10k浓缩至20 mg/mL贮存。蛋白质浓度用BCA试剂盒测定表征。

1.2.3 ZHD101野生型和突变体的活性与热稳定性的表征ZHD101活性测定方法由底物减少量来表征。 每个反应体系（210 μL）包含 5 μL 底物（1 mg/mL ZEN）和 5 μL 酶（0.25 mg/mL ZHD101，野生型或突变体），反应缓冲液为150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5。30 ℃反应 10 min之后，加入 50 μL 1 mol/L HCl和 300 μL 甲醇终止反应，产物过滤后取20 μL用于HPLC分析。样品被60%的乙腈以0.6 mL/min的流速洗脱下来，吸光度检测波长为254 nm。根据峰面积计算底物的减少量。

野生型蛋白分别在 45、55、65、75、85 ℃下加热处理1、2、10 min。热处理过后的蛋白质进行活性测定以表征其热稳定性。突变体蛋白质在55℃下热处理2 min后，测残余活性表征热稳定性。

2 结果与讨论

2.1 ZHD101热稳定性

将 ZHD101 蛋白质分别经过 45、55、65、75、85℃加热处理 1、2、10 min，测定残余酶活性，见图 1。ZHD101在45℃热处理1、2 min后，残余活性仍保持在90%以上；热处理10 min后，残余活性至少能保留70%。但是经过55℃热处理1 min后活性直接下降到30%。65、75、85℃热处理1 min后，残余活性直接降到20%以下。说明ZHD101热稳定性较差，难以耐受饲料生产制粒过程中的温度要求，需要通过分子改造的方法提高其热稳定性。

图1 ZHD101的热稳定性Fig.1 Thermostability of ZHD101

2.2 突变位点的选择

通过对ZHD101的分子结构（PDB ID：3wzm）的分析，发现其结构中存在两处B factor明显较高的部位（图2（a））。B factor是表征氨基酸残基的热不稳定状态和自由活动程度的重要参数，B factor高说明该残基的活动度可能较高，B factor平均值高的区域往往具有更弹性的状态和较低的热稳定性[18]。因此，在B factor较高即弹性较高的区域引入二硫键应能起到稳定局部结构的作用，从而提高酶的热稳定性[19-21]。基于上述普适原则，人们已开发相应的程序，根据B factor的高低更好的推测引入二硫键的位置以有效提高蛋白质的热稳定性[22]。在本研究中，我们将ZHD101分子结构在Pymol软件中根据B factor的大小直观的显示，在其中B factor较高的区域中引入七对二硫键（图2（b）），研究其对热稳定性的影响。

图2 ZHD101-ZEN复合体的结构和突变位点的选择Fig.2 Complex structure of ZHD101 with the substrate ZEN and the mutation sites distribution

2.3 ZHD101突变体的表达与纯化

含突变质粒pET46-zhd101-mutants的菌液经IPTG诱导后，离心收集上清液，高压破碎后离心制备总蛋白质，采用SDS-PAGE分析，结果见图3。IPTG诱导24 h后，在相对分子质量28 700附近处有明显的诱导条带，大小与目的片段相符，表明突变体蛋白获得成功表达。

突变重组酶经过Ni亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂进行两步纯化并透析除盐后，对纯化样品进行SDS-PAGE分析，结果见图4。纯化的蛋白质在28 700附近处显示为单一条带，与目的蛋白质相对分子质量大小相符，经活性测试验证为目的蛋白质，可用于后续酶学性质分析。

图3 ZHD101突变体表达的电泳图Fig.3 Expression of ZHD101 mutants

图4 ZHD101-mutants纯化电泳图Fig.4 Purification and the SDS-PAGE analysis of ZHD101-mutants

2.4 突变体的活性和耐热性表征

突变体蛋白纯化后稀释至0.25 mg/mL，进行活性和耐热性的测定，结果见图5（a）。D143C/P181C、S147C/P181C、L200C/A231C三个突变体的活性均为WT的90%以上；另外三个突变体A110C/P196C、D199C/A202C、R204C/G205C 的 活 性 仅 为WT的70%以上；而突变体S136C/R189C的活力只有WT的50%左右。50℃加处理2 min后，突变体R204C/G205C和L200C/A231C的残余活性和野生型一致；突变体 D199C/A202C、S147C/P181C和A110C/P196C的残余活性低于野生型，其中突变体A110C/P196C的残余活性最低。而突变体S136C/R189C和D143C/P181C的残余活性高于野生型，其中突变D143C/P181C的残余活性是野生型的两倍左右。在此基础上，我们设计了四突变S136C/D143C/P181C/R189C，活性测试结果见图 5（b）。 该突变体的活力为野生型的75%，而50℃加热处理2 min后的残余活性大约为野生型活性的两倍，即相对于双突变D143C/P181C，活性降低，热稳定性没有明显的改善。

图5 突变体和野生型的活性和耐热性比较Fig.5 Thermostability and activity comparison of the wide type and mutants

2.5 热稳定性提高的突变体形成二硫键的潜力分析

已知二硫键的χ3扭转角呈双相分布，集中在-80°和+100°两个区域，而形成二硫键的能量一般在0～4.5 kcal/mol范围内，均值为1.07 kcal/mol。经过Disulfide by Design软件分析，突变体D143C/P181C的两个半胱氨酸位点形成潜在二硫键的χ3扭转角和能量均符合要求，见表2，说明突变体在该位置有较大可能形成二硫键。而S136C/R189C两个半胱氨酸形成二硫键的χ3扭转角和能量不在上述范围内，表明形成二硫键的稳定性可能较低。

表2 突变体形成潜在的二硫键的扭转角和能量Table 2 Estimated χ3 torsion angle and an energy value of the mutation

2.6 突变体热稳定性提高的结构基础

通过对突变体D143C/P181C的结构分析，发现D143C存在于α1和α2之间的loop环上，P181C存在于α3的中间位置，二者形成的二硫键稳定了分子结构中B factor最高的这三个α螺旋，见图6。且α3螺旋中存在对酶活性起关键作用的重要氨基酸W183，W183通过与底物ZEN形成的氢键和堆叠作用稳定底物，该氨基酸的突变将使ZHD101完全失活[16]。因此，在此处引入二硫键，对稳定这三个α螺旋的位置、减少摆动、同时固定关键氨基酸W183的位置，均起重要的作用。因此，此处引入的二硫键能有效提高酶的热稳定性。同时，D143C/P181C二硫键的位置远离底物结合中心和催化三联体，对活性的影响很小。

另外，R189C/S136C双突变也增加了ZHD101的热稳定性。由图6可知，该处的二硫键同样可能是由于稳定了α1螺旋而增加结构的热稳定性。由于该处的二硫键仅稳定了一个α1螺旋，因此相对于D143C/P181C来说，热稳定性提高的程度略低。而四突变将上述两个二突变组合起来，R189C/S136C对α1螺旋的稳定作用被D143C/P181C对α1-α3三个螺旋的稳定作用所覆盖，因此四突变对热稳定性的贡献并不优于D143C/P181C双突变。

图6 两个热稳定性提高的双突变在分子结构中的位置Fig.6 Location of D143C/P181C andR189C/S136C double-mutations in ZHD101 structure

3 结 语

通过对蛋白质分子结构的分析，利用定点突变在结构中摆动度较大的位置引入半胱氨酸以形成潜在的二硫键，成功提高了内酯水解酶ZHD101的热稳定性。经过Disulfide by Design软件分析，证明其中引入的一对半胱氨酸符合形成二硫键的条件。进一步分析了两处二硫键提高ZHD101热稳定性的分子基础。本研究为酶的热稳定性改造提供了新的思路，同时为促进霉菌毒素降解酶ZHD101在饲料工业的应用打下了基础。