吴 芹，臧 嘉，胡 蝶，王 瑞，邬敏辰

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 214122）

木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8）从木聚糖主链的内部水解β-1，4-D-木糖苷键，是木聚糖降解酶系中的关键组分，广泛存在于各种生物体中。随着低聚木糖生理功能的发现、加酶饲料的兴起及人类环保意识的增强，木聚糖酶在许多工业领域如食品、饲料、纺织和造纸等中的应用潜力日趋凸显[1-2]。目前商品化的木聚糖酶多为中温酶，最适温度在45～55℃范围内，然而酶在使用过程中经常会遭遇或需要高温环境，如在纸浆漂白和饲料造粒工艺中需要60～80℃的温度，因此耐热性差已成为制约木聚糖酶发展的瓶颈。

木聚糖酶主要归属糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase families，GHFs） 10 和 11，GHF11 木聚糖酶的三维结构由一个α-螺旋、两个反向平行的β-折叠片A和B及若干loops构成，呈右手半握形状[3]。随着人们对木聚糖酶的结构与功能及作用机理的认识不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的耐热木聚糖酶的研究得到了快速发展。Zhang等[4]将Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶 SoxB的 N端与Thermomonospora fusca耐热酶TfxA的对应区域互换，获得最适温度和温度稳定性大幅度提高的杂合木聚糖酶STxAB。Ayadia等[5]将位于Trichoderma reesei木聚糖酶三维结构表面的Ser单点和双点突变为Thr，其中双点突变酶（S80T-S149T）在55℃的半衰期由野生型酶的20 min延长至37 min。Qian等[6]对白蚁GHF11木聚糖酶XYL7实施定点饱和突变，获得了两个最适温度均比野生型酶提高10℃的突变酶（XYL7-TC和XYL7-TS）。

Aspergillus oryzaeGHF11木聚糖酶AoXyn11A（GenBank：AFA51067）是一种具有优良酶学性质的生物催化剂，但其耐热性较差[7]。本研究基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟，拟将Gly21随机替换为其他氨基酸。以pET-28a-Aoxyn11A为对象，对Aoxyn11A中编码Gly21的密码子实施饱和突变，构建突变转化子文库，并从中获得表达最高温度稳定性木聚糖酶的最优突变转化子。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒米曲霉 （Aspergillus oryzae）CICC40186：购自中国工业微生物菌种保藏中心；大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3） 和表达质粒pET-28a（+）：购自Novagen公司；重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A和大肠杆菌转化子E.coli/Aoxyn11A：由作者所在实验室构建和保藏。

1.1.2 主要试剂和引物 PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性内切酶 DpnⅠ、DNA Marker和蛋白质Marker：购自大连TaKaRa公司；IPTG、胰蛋白胨和酵母提取物：购自上海Sangon公司；D-木糖、桦木木聚糖和考马斯亮蓝R-250：Sigma公司产品；其他试剂均为分析纯。PCR引物委托Sangon公司合成见表1，用于Aoxyn11A的定点饱和突变。

表1 Aoxyn11A定点饱和突变的PCR引物Table 1 PCR primers for the site-saturated mutagenesis of Aoxyn11A

1.1.3 培养基LB液体培养基：1 g/dL胰蛋白胨、0.5 g/dL 酵母提取物和 1 g/dL NaCl，pH 7.2；LB 固体培养基：添加1.8 g/dL的琼脂粉；LB抗性培养基：添加终浓度为100 μg/mL的卡那霉素。

1.2 实验方法

1.2.1 同源建模和分子动力学模拟在PDB数据库中搜索与AoXyn11A一级结构同源性高的且已知晶体结构的GHF11木聚糖酶，选取其中的3种晶体结构 （PBD：1TE1，2VUL和 1ENX）为模板， 运用SALIGN多空间结构比对程序（http：//salilab.org/DBAli/?page=tools_&action=f_salign）和 MODELLER 9.11 建模程 序 （http：//salilab.org/modeller/） 进行AoXyn11A三维结构的多模板同源建模及优化。运用 GROMACS 4.5 程序包（http：//www.gromacs.org/）并参照Yin等[8]的方法对AoXyn11A的三维结构进行分子动力学（molecular dynamics，MD） 模拟，选择将最高温度因子B-factor值位点处的Gly21随机替换为其他氨基酸。

1.2.2 突变转化子文库的构建和筛选以pET-28a-Aoxyn11A为模板、G21X-F和X11-R为引物，采用全质粒两步PCR（two-stage whole-plasmid PCR）[9]对Gly21密码子实施饱和突变。将pET-28a-Aoxyn11A突变体用DpnⅠ消化，转化E.coliBL21，构建突变转化子文库。从文库中挑选96个转化子（E.coli/Aoxyn11AG21X，X代表任意氨基酸），接种于500 μL LB抗性培养基中，37℃、220 r/min培养12 h，以2%接种体积分数转接相同的培养基，培养至OD600约为0.8时，加入0.5 mmol/L IPTG，16℃诱导表达8 h。离心收集菌体，用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液（50 mmol/L、pH 5.5）悬浮，反复冻融破碎细胞，上清液作为粗酶液。将酶液60℃保温20 min，适当稀释后取5 μL加入95 μL 0.5 g/dL桦木木聚糖溶液（相同缓冲液配制）中，借助PCR仪进行催化和显色反应（50 ℃ 15 min，加 50 μL DNS 试剂，95 ℃5 min，冷却至10℃）。加入96孔板中，用酶标仪测定OD540nm值。残余酶活性大于50%的突变木聚糖酶所对应的转化子定义为正突变子，对其进行DNA测序。延长60℃保温时间，从正突变子中获得最优突变转化子。

1.2.3 木聚糖酶的纯化按上述方法分别将E.coli/Aoxyn11A和最优突变转化子在30 mL LB抗性培养基中进行诱导表达，用3 mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液重悬菌体，冰浴超声波破碎细胞，上清液在4℃用Ni-NAT亲和层析柱 （北京Tiandz公司）纯化目的酶蛋白。采用SDS-PAGE分析重组表达产物。

1.2.4 木聚糖酶活性的测定参照Bai等[10]的方法并略作修改。在2.4 mL 0.5%桦木木聚糖溶液（pH 5.5、50 mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制）中加入0.1 mL适当稀释的酶液，50℃反应15 min，再加入2.5 mL DNS试剂，沸水浴显色7 min，测定OD540nm值。在上述反应条件下，1个木聚糖酶活性单位（U）定义为每分钟产生1 μmol还原糖 （以D-木糖计）所需的酶量。

1.2.5 木聚糖酶酶学性质的分析

1）温度对酶活性的影响：在不同温度（45～75℃）下，按1.2.4的方法测定木聚糖酶活性。最适温度定义为最高酶活性（相对酶活性100%）所对应的温度。将酶液在35～65℃下处理1 h，按1.2.4的方法测定残余木聚糖酶活性，未经处理酶液的酶活性以100%计。温度稳定性定义为残余酶活性大于85%所对应的温度。

2）pH对酶活性的影响：用pH 3.5～7.5的缓冲液配制0.5%桦木木聚糖溶液，按1.2.4的方法测定木聚糖酶活性。最适pH定义为最高酶活性所对应的pH值。将酶液在pH 3.5～7.5、35℃下处理1 h，按1.2.4的方法测定残余木聚糖酶活性。pH稳定性定义为残余酶活性在85%以上所对应的pH范围。

1.2.6 统计学分析实验结果以 “均数±标准差”（x±s）表示，应用SPSS 20.0统计分析软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和t检验。

2 结果与分析

2.1 AoXyn11A三维结构的同源建模

已知晶体结构的GHF11木聚糖酶与AoXyn11A的一级结构同源性均小于72%，因此本研究选取同源性相对较高、分别源自Penicillium funiculosum（1TE1）、E.coli（2VUL） 和Hypocrea jecorina（1ENX）的3种木聚糖酶晶体结构作为模板，采用SALIGN和MODELLER 9.11进行AoXyn11A三维结构的多模板同源建模及优化，见图1。已有研究表明，目标蛋白质三维结构同源建模的准确度主要取决于其与模板蛋白质的一级结构同源性高低，当同源性不高时，单模板同源建模的准确度较低[11]。

2.2 拟随机替换位点的选定

蛋白质构象的刚性与其各位点处氨基酸的B-factor值成负相关性[12]。运用GROMACS 4.5对AoXyn11A三维结构进行了MD模拟，计算出各氨基酸的B-factor值，见图2。由图2可见，AoXyn11A中 Gly21的 B-factor值最高 （70.27 Å）， 故选定将Gly21随机替换为其他氨基酸。

图1 AoXyn11A的三维结构模型Fig.1 Three-dimensional structure model of AoXyn11A

图2 AoXyn11A各位点处氨基酸残基的温度因子B-factor值Fig.2 B-factor values of amino acid residues in the sites of AoXyn11A

2.3 最优突变转化子的获得

将E.coli/Aoxyn11A和96个E.coli/Aoxyn11AG21X所表达的木聚糖酶在60℃保温20 min，测定残余酶活性。结果显示，AoXyn11A活性完全丧失，而4种突 变 酶 （AoXyn11AG21I、AoXyn11AG21F、AoXyn11AG21V和AoXyn11AG21L）的残余活性大于50%，见图3。延长保温时间至30 min，测得4种酶的残余活性分别为57.3、39.3、30.5和37.1%，从而获得了最优突变转化子E.coli/Aoxyn11AG21I。

2.4 木聚糖酶的纯化和分析

E.coli/Aoxyn11A和E.coli/Aoxyn11AG21I经IPTG诱导表达和超声波破碎细胞，上清液采用Ni-NAT柱纯化目的酶蛋白。SDS-PAGE分析显示，纯化的AoXyn11A和AoXyn11AG21I均约在相对分子质量24 100处呈现单一条带（图4泳道2和4）。

图3 AoXyn11A及其4种代表性突变酶N端的30个氨基酸残基Fig.3 N-terminal 30 amino acid residues of AoXyn11A and its four representative mutants

图4 大肠杆菌转化子表达产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed products in E.coli transformants

2.5 木聚糖酶酶学性质的分析

2.5.1 最适温度和温度稳定性温度对AoXyn11A和AoXyn11AG21I活性的影响见图5。由图5（a）可见，AoXyn11AG21I的最适温度为65℃，较AoXyn11A提高了 10℃；由图 5（b）可见，AoXyn11AG21I和AoXyn11A分别在48、55℃及以下稳定。测定结果表明，将AoXyn11A中的Gly21替换为Ile21明显改善了其温度特性。

图5 AoXyn11A和AoXyn11AG21I的最适温度和温度稳定性Fig.5 Temperature optima and stabilities of AoXyn11A and AoXyn11AG21I

2.5.2 最适pH和pH稳定性分析了pH对AoXyn11A和AoXyn11AG21I活性的影响。AoXyn11A和AoXyn11AG21I的最适pH均为5.5；在pH 5.0～7.0范围内残余酶活性均大于85%。测定结果表明，Gly21替换为Ile21对AoXyn11A的pH特性改变不大。

2.6 木聚糖酶三维结构的分析

Gly侧链仅有一个氢原子，由于缺乏长侧链的约束，致使多肽链在Gly残基位点处呈现柔性构象；另外，Gly具有最高的构象熵，在解折叠过程中所需能量最少。因此，将特定位点处的Gly突变为其他氨基酸可有效改善GHF11木聚糖酶温度特性[13]。由图1可见，Gly21使AoXyn11A在该位点处的柔性较强，导致其温度稳定性较差。将Gly21突变为Ile21（支链氨基酸）提高了AoXyn11A构象的刚性并降低了熵，对改善其温度特性起促进作用。

AoXyn11A的Gly21位于连接β折叠股B2和A2的 loop上。运用 PIC程序（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/）分析AoXyn11A和AoXyn11AG21I构象中存在的作用力。结果表明，除了共同存在的疏水作用外，AoXyn11A中P3-F16和I58-V74形成了2对疏水作用； 而 AoXyn11AG21I中 I21-V41、Y34-V172、Y71-L72、A73-I87、V74-V172、Y102-I115、Y113-I115、I115-L162和W157-Y160形成了9对疏水作用。另外，AoXyn11AG21I较AoXyn11A多出了3对氢键和1对盐桥（E84-R120）。许多研究表明，疏水作用、氢键、盐桥和二硫键等对酶的热稳定性起重要作用[14]。

3 结 语

酶在各领域的应用常受限于其热稳定性差，如何获得性质优良的耐热酶已成为研究人员所面临的挑战。基因工程技术中的定点饱和突变在改善酶学性质如温度和pH特性、比活性、对映和区域选择性及底物特异性等方面备受关注。本研究基于生物数据库的相关数据并借助多种生物软件对AoXyn11A的三维结构进行多模板同源建模和分子动力学模拟，设计将其最高温度因子B-factor值处的Gly21随机替换为其他氨基酸，采用定点饱和突变技术构建了转化子文库，筛选获得了的最优突变酶转化子AoXyn11A。与AoXyn11A相比，突变酶AoXyn11AG21I的最适温度和温度稳定性有明显的提高。本设计方案为木聚糖酶及其它酶蛋白的热稳定性定向改造提供了一种新的途径。