陈淑萍， 孙玉英， 谈 勇*

（1.南京中医药大学，江苏 南京210023；2.常州市中医医院，江苏 常州213000）

卵巢储备功能下降是指卵巢内所剩卵母细胞的数量、质量、潜能下降，导致女性生育力下降，性激素缺乏，常指双侧卵巢窦卵泡数＜6 个，抗苗勒管激素（AMH） 值低于0.5～1.1 ng／mL［1］。治疗方法以激素补充治疗（HRT）为主，但长时间应用后会增加卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌的发生风险［2-5］，患者依从性差；对有生育要求而采用体外受精-胚胎移植（IVF-ET） 的患者，也存在着周期取消率高、获卵率及优胚率低等问题，从而导致不良结局。

坤泰胶囊为仲景名方“黄连阿胶汤” 化裁而来，由熟地黄、黄连、白芍、阿胶、黄芩、茯苓组成，具有滋阴清热、安神除烦、交通心肾的作用，在妇科疾病中应用广泛，对卵巢储备功能下降的疗效尤佳［6-8］。本实验旨在基于TGF-β／smads 信号通路观察坤泰胶囊对卵巢储备功能下降大鼠卵巢组织smad2／3／7 分子表达的影响，以期探索其相关分子机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 8 周龄SPF 级雌性SD 大鼠65 只，体质量（210±10） g，购自浙江省实验动物中心，动物合格证号SCXK（浙） 2014-0001， 自由饮水和摄食， 室温 （22±2）℃，相对湿度50%～70%，昼夜各12 h。

1.2 试剂 雷公藤多苷片（浙江得恩德制药有限公司，50 mg／片，批号Z33020422）。坤泰胶囊（贵阳新天药业股份有限公司，0.5 g／粒，批号Z20000083）；戊酸雌二醇（补佳乐） （拜耳医药保健有限公司广州分公司，1 mg／片，批号J20130009）；黄体酮胶囊（安琪坦） （浙江仙琚制药股份有限公司，0.1 g／片，批号H20041902）。

1.3 仪器 CX21 型高分辨显微镜（日本Olympus 公司）；ABI7500 型Real-time PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）；Mastercycler nexus PCR 仪、台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；垂直电泳槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司）；TS-1000 型脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司）；TS-12F 型生物组织自动脱水机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；BMJ-M 型病理组织包埋机和包埋冷冻台（天津天利航空机电有限公司）；EnSpire 2300 型酶标仪（上海巴玖实业有限公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 65 只大鼠适应性喂养6 d，期间进行阴道脱落细胞涂片观察，确认所有大鼠动情周期变化规律，随机分为正常组10 只、模型组55 只。参照高慧等［9-11］方法，将雷公藤多苷片以生理盐水配成50 mg／kg 剂量，每日上午9 点开始连续灌胃14 d，正常组大鼠同时予等体积生理盐水。造模第8 天起，进行阴道脱落细胞学涂片，观察大鼠动情周期变化，剔除造模失败者后随机分为模型组、西药组各11 只，以及坤泰胶囊组、中西药组各12 只。西药组对处于动情前期的大鼠先给予戊酸雌二醇片（0.12 mg／kg）2 d，再给予黄体酮胶囊（18 mg／kg） 2 d，对处于动情后期的大鼠给药顺序恰好相反；坤泰胶囊组灌胃给药剂量0.5 g／kg；中西药组在坤泰胶囊基础上加用上述2 种西药；正常组、模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水。给药期间，各组大鼠按体质量调整给药剂量，连续给药3 个动情周期。

2.2 取材 药物干预结束后15 d（保证所有大鼠处于动情前期） 大鼠禁食不禁水，第2 天水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，无菌下迅速取出卵巢组织，称定质量，一半置于-80 ℃冰箱中待测，另一半置于4%多聚甲醛中待测。

2.2.1 HE 染色 将置于4%多聚甲醛中的大鼠卵巢组织用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规HE 染色，光学显微镜下观察卵巢变化。

2.2.2 血清E2、LH、FSH、AMH 水平检测 大鼠血液静置30 min 后离心， 取上清液， ELISA 法检测E2、 LH、FSH、AMH 水平。

2.2.3 大鼠卵巢组织Smad2／3／7 蛋白表达检测 采用Western blot 法。 蛋白定量变性后SDS-PAGE 凝胶电泳1.2 h，半干转，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃摇床过夜（β-actin 为1 ∶2 000、Smad2／3 为1 ∶2 000、Smad7 为1 ∶1 000），二抗（1 ∶2 000） 室温下孵育2 h，曝光，Image J软件测定目的条带OD 值，以β-actin 为内参，将目的条带、β-actin OD 值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2.2.4 大鼠卵巢组织Smad2／3／7 mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。Trizol 提取RNA 后测定其浓度，按50 μL 反应体系逆转录，然后进行RT-PCR 反应，引物序列见表1。条件为cDNA 2 μL，引物浓度0.3 μmol／L；反应参数为预变性，95 ℃30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火，延伸34 s，40个循环。反应结束后，以β-actin 为内参，2-△△Ct法分析mRNA 相对表达量。

表1 引物序列

2.3 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用LSD 和SNK-q 检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 模型评价 给予雷公藤多苷片的55 只大鼠呈现不同程度的动情周期紊乱，表现为延长与停滞。连续灌胃2 周后，46 只大鼠出现连续动情周期紊乱，造模成功率为83.6%；2 周治疗结束后，阴道脱落细胞涂片显示28 只大鼠动情周期恢复（28／46，60.9%），其中模型组3 只（3／11，27.3%），西药组8 只（8／11，72.7%），坤泰胶囊组8只（8／12，66.7%），中西药组9 只（9／12，75%）。

3.2 血清性激素水平 表2 显示，与正常组比较，模型组血清AMH、E2 水平显著降低，LH、FSH 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，坤泰胶囊组、中西药组、西药组AMH、E2 水平显著升高（P＜0.05），中西药组、西药组FSH、LH 水平显著降低（P＜0.05）。

表2 各组血清性激素水平比较n＝10）

表2 各组血清性激素水平比较n＝10）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05

组别 AMH／（ng·L-1） E2／（pg·mL-1） FSH／（U·L-1） LH／（U·L-1）正模坤中西常型泰西药组组胶药组 囊组 组 11111 60554.....17958 95928±±±±±21111.....54978 17207 △*** 63565 49509.....46403 14629±±±±±36474.....25915 61112 △*** 11111 06423.....00221 59931±±±±±11121.....98513 99269 △** 22222 16534.....66854 34174±±±±±21111.....36481 15976*△**

3.3 大鼠卵巢组织形态 图1 显示，与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织萎缩明显，HE 染色可见各级卵泡减少，卵泡结构破坏，黄体少且发育欠佳；与模型组比较，药物干预后大鼠上述情况改善，可见窦卵泡、原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡，以及卵细胞、卵丘、透明带、放射冠结构，卵泡外围包绕的颗粒细胞层数、黄体数量增多，排列规则，发育尚可。

图1 各组大鼠卵巢组织变化（HE 染色，×40）

3.4 Smad2／3／7 mRNA 表达 表3 显示，与正常组比较，模型组Smad2／3 mRNA 表达显著降低，Smad7 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，坤泰胶囊组、中西药组、西药组前者mRNA 表达显著升高，后者mRNA表达显著降低（P＜0.05）。

表3 各组Smad2／3／7 mRNA 表达的比较n＝10）

表3 各组Smad2／3／7 mRNA 表达的比较n＝10）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05

组别 Smad2 Smad3 Smad7正常组 1.33±0.31 1.56±0.16 0.46±0.18模型组 0.78±0.26△ 0.84±0.25△ 1.18±0.22△坤泰胶囊组 1.25±0.23* 1.24±0.20* 0.59±0.29*中西药组 1.08±0.19* 1.36±0.27* 0.63±0.26*西药组 1.12±0.28* 1.23±0.17* 0.82±0.34*

3.5 Smad2／3／7 蛋白表达 图2、表4 显示，与正常组比较，模型组Smad2／3 蛋白表达显著降低，Smad7 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，坤泰胶囊组、中西药组、西药组（除Smad3 外） Smad2／3 蛋白表达显著升高（P＜0.05），三组Smad7 蛋白表达显著下降（P＜0.05）。与西药组比较，坤泰胶囊组、中西药组Smad3 蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

图2 各组Smad2／3／7 蛋白表达

表4 各组Smad2／3／7 蛋白表达的比较n＝10）

表4 各组Smad2／3／7 蛋白表达的比较n＝10）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与西药组比较，＃P＜0.05

组别 Smad2 Smad3 Smad7正常组 0.60±0.20 0.61±0.02 0.18±0.02模型组 0.28±0.21△ 0.31±0.02△ 0.37±0.02△坤泰胶囊组 0.64±0.25* 0.51±0.23*＃ 0.20±0.15*中西药组 0.55±0.04* 0.49±0.01*＃ 0.21±0.02*西药组 0.59±0.02* 0.32±0.04 0.29±0.16*

4 讨论

雷公藤多苷是一种细胞毒性药物，对机体内分裂增殖较快的细胞作用明显，导致其DNA 碱基错配，引起DNA链断裂，对卵巢的卵泡细胞有较强毒副作用，近年来被广泛用于卵巢储备功能下降模型的建立，该方法所需时间短，成功率高，简便易行，致病途径与人类相同，而且符合模型卵巢组织萎缩，卵泡、黄体数量、卵泡颗粒细胞减少，炎细胞浸润等特点。造模剂量及时间参照文献［9］，以50 mg／（kg·14 d） 造模最理想。

中医并无“卵巢储备功能下降” 这一病名，但可将其归于“不孕症” “月经过少” “月经后期” “血枯” “闭经”等范畴，认为肾藏精，主生殖，肾虚是本病根本病机，肾虚阴阳失调，影响及心，心不静则肾不实，久而必致肾虚，心肾子宫轴失调，产生各种复杂病变；国医大师夏桂成认为，本病主要病机为“心肾不交”，主要治法为“交济心肾，以调心为主”。坤泰胶囊系由仲景名方“黄连阿胶汤”化裁而来，方中熟地、阿胶、白芍、茯苓滋肾阴，养精血，黄连、黄芩清热泻火，能有效改善因卵巢功能减退而引起的症状；现代药理研究表明，方中熟地、白芍具有雌激素样作用［12］，可升高 妇女血清E2 水平［13］； Huang 等［14］认为，坤泰胶囊等中药可能通过调节GnRH 分泌来促进卵泡发育与排卵，改善子宫血流，调节子宫内膜。

卵巢储备功能下降作为临床常见病，其发病率逐年上升，严重影响育龄女性生殖健康及生活质量，目前主要围绕卵泡生成障碍、卵泡耗竭加速来探讨其机制［15］。TGF-β信号通路作为卵巢内经典信号传导途径，广泛参与调节细胞生长及分化，对卵泡发育许多阶段都至关重要，包括原始卵泡形成、颗粒细胞增殖、卵泡闭锁、排卵、垂体与卵巢之间反馈调节，其超家族的级联反应是卵泡形成和排卵的关键调控途径［16-21］。Smad 蛋白作为TGF-β 信号通路的下游信号传导分子，在其信号传导中起到重要作用，受体调节型蛋白Smad2／3 被TGF-βⅠ型受体磷酸化和激活，磷酸化的Smad2／3 与共同调节型蛋白Smad4 结合形成异聚复合物，并通过募集不同转录因子、共激活因子、辅助受体在细胞核中累积以调节基因表达［22-23］，而Smad7 作为抑制型Smad 发挥负调节功能［24-28］。研究表明，在缺乏Smad3 的情况下，FSH 上调其自身受体的能力下降，但当其表达恢复时FSHR 表达增加， 恢复了它们对FSH 干预的反应能力［29］。由于Smad2、Smad3 高度同源，故通过两者发出的信号能增加培养的颗粒细胞中FSHR mRNA 表达［30-31］，而SMAD7 则在小鼠GCs 中介导由TGF-β 诱导的细胞凋亡，故可通过防止过早的GCs 凋亡来支持卵泡发育［32］。本实验显示，与正常组相比模型组大鼠E2、AMH 水平下降，FSH、LH 水平上升，Smad2／3 蛋白及mRNA 表达下降，Smad7 蛋白及mRNA 表达上升；坤泰胶囊干预后， 各项激素和Smad2／3／7 蛋白及mRNA 表达均有不同程度改善，可见各级卵泡发育，卵泡外围包绕的颗粒细胞层数较模型组多，黄体数量较模型组多，发育尚可。FSH 参与调节卵泡的生长发育，可见坤泰胶囊通过提高大鼠血清E2 水平，上调大鼠卵巢组织Smad2／3 表达来提高大鼠卵巢组织FSHR 表达，增加卵巢组织对FSH 的反应性，降低血清FSH 水平；下调大鼠卵巢组织Smad7 表达，防止卵泡过早凋亡，从而促进和维持卵泡生长发育。

虽然本实验未对大鼠卵巢组织进行体外实验，但发现坤泰胶囊可能通过提高大鼠E2 分泌水平，降低FSH、LH分泌，调控大鼠卵巢组织Smad2／3／7 表达（即上调Smad2／3表达，下调Smad7 表达），调控TGF-β／Smads 信号通路中正、负调节蛋白表达，从而促进和维持卵泡的生长发育，可能是其改善卵巢功能的机制。