杨桃根多糖提取工艺优化及其体外活性

2019-10-16廖彭莹李典鹏扈芷怡陈慧萍杨小妹吴勇燕

中成药 2019年9期

廖彭莹，李典鹏，扈芷怡，陈慧萍，杨小妹，吴勇燕

（1.广西中医药大学，广西南宁530001；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林541006）

杨桃根为酢浆草科五敛子属植物杨桃Averrhoa carambola L.的根或根皮，其味酸、涩，性平，具有祛风除湿、行气止痛、涩精止带的功效［1］，含有类型丰富的活性成分［2-6］，其中多糖具有降血糖、抗氧化作用［5-7］。

糖尿病是以持续高血糖为主要生化特征的综合代谢性疾病，发病率持续增加，目前我国患病人数已居世界第一［8］。α-葡萄糖苷酶是食物中碳水化合物水解的关键酶，相关抑制剂通过抑制其活性来阻滞多糖、双糖水解，延缓葡萄糖吸收，从而使血糖平稳缓慢地维持在一定水平［9］，部分植物多糖已证实具有较强抑制活性［10-12］，但杨桃根多糖相关研究尚无报道。因此，本实验将优化杨根多糖提取工艺，并评价其体外活性，以期为该成分开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；BSA224S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；恒温水浴器（金坛市医疗仪器厂）；PH 计（德国赛多利斯公司）；微量移液器（德国Eppendorf 公司）。

1.2 药材杨桃根于2015 年6 月采于广西南宁，经广西中医药大学朱意麟实验师鉴定为酢浆草科五敛子属植物杨桃Averrhoa carambola L.的根，粉碎过40 目筛后备用。

1.3 试剂维生素C 购自天津博迪化工股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自上海伊卡生物技术有限公司；过硫酸钾购自中国医药集团上海化学试剂公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖购自美国Sigma 公司；D-（＋） -葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材预处理称取药材粉末600 g，加入3 000 mL 石油醚回流提取3 次，每次1 h，药渣挥干，加入95%乙醇3 000 mL 回流提取3 次，每次1 h，药渣挥干，得到药渣555 g。

2.2 多糖含有量测定

2.2.1 线性关系考察精密吸取不同体积葡萄糖对照品溶液（0.10 mg／mL）于50 mL 量瓶中，蒸馏水定容，摇匀，精密吸取2 mL 于10 mL 具塞试管中，加入苯酚1 mL、浓硫酸8 mL，摇匀，冷却，静置30 min；另取2 mL 蒸馏水同法操作，作为空白参比，在485 nm 波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为A ＝10.045X ＋0.054 06 （r ＝0.999 1），在0.010 ～0.060 mg／mL 范围内呈良好的线性关系。

2.2.2 方法学考察

2.2.2.1 精密度试验精密吸取0.05 mg／mL 多糖溶液6 份，每份1.5 mL，置于10 mL 具塞试管中，按“2.2.1” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为0.40%，表明仪器精密度良好。

2.2.2.2 稳定性试验精密吸取0.05 mg／mL 多糖溶液1.5 mL，置于10 mL 具塞试管中，按“2.2.1” 项下方法测定吸光度，每隔30 min 1 次，测得其RSD 为0.64%，表明溶液在3 h 内稳定性良好。

2.2.2.3 重复性试验精密称取药材5 份，每份1 g，按“2.1” 项下方法预处理后将药渣挥干，加入50 mL 蒸馏水煎煮2 次，每次1 h，过滤得到水提液，定容至100 mL 量瓶中，精密量取1.5 mL 于10 mL 具塞试管中，按“2.2.1” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.57%，表明该方法重复性良好。

2.2.2.4 加样回收率试验精密吸取5 份0.05 mg／mL多糖溶液，每份5 mL，加入0.1 mg／mL对照品溶液1.5 mL，定容至10 mL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率为98.10%，RSD 为5.51%。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间精密称取适量药渣（M1），置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入料液比1 ∶30 的蒸馏水，超声（40 kHz、200 W）处理20、30、40、50、60 min，每组平行3 次。所得提取液过滤，滤液减压浓缩至约10 ～15 mL，加入4 倍量无水乙醇至含醇量为80%，静置过夜，抽滤，沉淀用无水乙醇、乙醚、丙酮各5 ～10 mL 洗涤，减压干燥，得到多糖，精密称定质量（M2），计算提取率，公式为提取率＝M2／M1×100%，结果见图1。由图可知，随着提取时间延长，多糖提取率逐渐上升，在50 min 时最高，为1.85%，但继续延长时反而明显下降，故选择30～50 min 作进一步优化。

图1 提取时间对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.3.2 提取温度精密称取适量药渣于250 mL 具塞锥形瓶中，加入料液比1 ∶30 的蒸馏水，提取温度50、60、70、80、90 ℃，超声处理30 min，每组平行3 次，提取液过滤，按“2.4.1” 项下方法计算多糖提取率，结果见图2。由图可知，随着提取温度升高，多糖提取率缓慢增加，在60 ～70 ℃之间最高，但继续升高时反而明显下降，故选择50～70 ℃作进一步优化。

图2 提取温度对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.3.3 料液比精密称取适量药渣于250 mL 具塞锥形瓶中，加入料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 的蒸馏水，提取温度70 ℃，超声处理30 min，每组平行3 次，提取液过滤，按“2.3.1” 项下方法计算多糖提取率，结果见图3。由图可知，料液比1 ∶20、1 ∶40 时多糖提取率最高，但1 ∶50 时明显下降，可能是后期处理过程中提取液过多而造成多糖损失，故选择料液比1 ∶20～1 ∶40 作进一步优化。

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.4 正交试验在单因素试验基础上，选择提取时间（30、 40、 50 min）、提取温度（50、 60、70 ℃）、料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40）作为影响因素，多糖提取率作为评价指标，设计L9（34）正交试验，每组3 个平行。结果见表1，方差分析见表2。

表1 试验设计及结果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表1 可知，各因素影响程度依次为提取温度＞料液比＞提取时间，最优工艺为A3B1C2，即提取温度70 ℃，提取时间30 min，料液比1 ∶30。由表2 可知，提取温度、料液比具有显著影响（P＜0.05），而提取时间无显著影响（P＞0.05）。

2.5 验证试验按照优化工艺进行提取，平行3次，测得多糖提取率分别为1.92%、 1.87%、1.99%，平均1.93%，表明工艺稳定性良好。

2.6 多糖精制及光谱分析采用Sevag 法对多糖溶液进行除蛋白［13］，向脱蛋白多糖溶液中加入1%双氧水进行脱色，再向溶液中加入乙醇至含醇量为80%，4 ℃下静置过夜，离心，沉淀用丙酮、乙醇分别洗涤，50 ℃下烘干，即得精制多糖。然后，将其配成0.1 mg／mL，紫外分光光度法在200 ～400 nm波长范围内扫描，发现在260、280 nm 处均无明显吸收峰，表明不含核酸和蛋白质［14］。

2.7 多糖体外活性研究

图4 多糖对ABTS·＋清除率的影响Fig.4 Effect of polysaccharides on the scavenging rate of ABTS·＋

2.7.2 清除DPPH· 取多糖溶液、0.2 mmol／L DPPH 自由基溶液各100 μL，作为样品组；以等体积无水乙醇代替DPPH 自由基溶液，作为空白组；以等体积蒸馏水代替多糖溶液，作为对照组，每组平行3 次，混合均匀后常温下避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度，按“2.7.1” 项下方法计算清除率，结果见图5。由图可知，在0.2 ～2.0 mg／mL范围内多糖对DPPH·的清除率随着其质量浓度增加而不断升高，EC50为0.33 mg／mL。