柴 爽， 黄佳纯， 王吉利， 黄宏兴， 万 雷， 刘少津， 卢 义

（1.广州中医药大学，广东 广州510006；2.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东 广州510405；3.广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室，广东 广州510006）

绝经后，女性由于卵巢功能衰退，体内雌激素水平下降，骨骼效应消除后促进了骨质疏松症的发生［1］，此时患者骨量减少，骨脆性增加，轻微外力即可引发骨折，严重影响了生活质量。前期研究发现，补肾健脾活血方可明显缓解老年骨质疏松症女性患者的疼痛症状［2］，降低骨质疏松性椎体压缩骨折术后椎体再骨折的风险［3］，其含药血清还可通过调控wnt／β-catenin 信号通路抑制因子DKK1 影响成骨细胞的代谢［4］。本实验采用去卵巢大鼠绝经后骨质疏松症模型，探讨补肾健脾活血方对骨密度、生物力学性能的改善作用，以及对wnt／β-catenin 信号通路的影响。

1 材料

1.1 动物 雌性SD 大鼠72 只，6 月龄，SPF 级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK （粤）2013-0034。实验在广州中医药大学实验动物中心SPF 级实验室（温度21～25 ℃，相对湿度50%～70%，12 h 交替光照） 进行，喂饲大鼠专用饲料（广州中医药大学动物实验中心）。

1.2 试药 补肾健脾活血方为广州中医药大学附属骨伤科医院院内制剂（批件号20170030），由补骨脂、淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣10 味中药组成，生药量1.43 g／mL。阿仑膦酸钠维D3片（Ⅱ） （杭州默沙东制药有限公司，生产批号N010878）。Trizol 购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司；全细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；wnt3a、β-catenin 抗体购自北京四正柏生物科技有限公司；Tublin、GAPDH 抗体购自ABclonal 公司；山羊抗兔、山羊抗鼠二抗购自美国CST公司。

1.3 仪器 双能X 射线骨密度仪小动物专用扫描和分析软件（美国Hologic 公司）；MTS-858miniBionix 生物材料力学试验机（美国MTS 公司）；T100 梯度PCR 仪；CFX96 实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 72 只大鼠适应性饲养1 周后，随机分为假手术组（24 只） 和手术组（48 只），采用背侧入路双侧卵巢切除法造模，假手术组切除双侧卵巢旁脂肪组织（体积约等于卵巢），术后1 周每天肌肉注射青霉素8万单位以预防切口感染。术后3 个月，2 组各随机选取12只大鼠检测腰椎骨密度以验证造模成功，手术组剩余的36只随机分为模型组、补肾健脾活血方组、阿仑膦酸钠维D3片（Ⅱ） 组，每组12 只。药物用量参考第3 版《药理实验方法学》 中的等效剂量换算方法，大鼠用药量＝人用剂量／60×6.3，补肾健脾活血方、阿仑膦酸钠维D3片（Ⅱ）（于研钵内研磨， 生理盐水溶解） 日临床剂量分别为20 mL、10 mg，分别按2.979 g／kg、1.02 mg／kg 剂量灌胃给药，而假手术组、模型组灌胃给予等体积生理盐水，各组每天1 次，连续3 个月。

2.2 骨密度检测 大鼠麻醉生效后取俯卧位，采用双能X射线扫描鼠全身，设定腰椎为感兴趣区，通过仪器自带软件进行腰椎骨密度分析。

2.3 标本采集 末次给药后大鼠禁食，次日腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL／100 g 体质量） 麻醉，检测骨密度。然后，处死各组大鼠，迅速分离腰4（L4） 椎体，生理盐水湿纱布包裹，-20 ℃下保存备用，迅速分离右侧胫骨，剔除周围附着软组织，置于液氮中保存备用。

2.4 骨生物力学检测 检测前12 h，于-20 ℃冰箱中取出L4 椎体，去除椎间盘、附件、终板，砂纸打磨上下两端以保证两面水平，室温下解冻后MTS 法进行腰椎压缩实验，根据仪器自带软件导出的数据分析腰椎最大载荷和刚度。

2.5 wnt2、 wnt3a、 lrp5、 lrp6、 β-catenin、 OPN、 Runx2、osterix mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取大鼠胫骨近端骨组织约30 mg，液氮研磨后Trizol 法提取总RNA，Thermo 全长酶标仪测定其浓度和纯度，取500 ng 进行逆转录反应合成cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR 反应。反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，dH2O 补平体积15 μL；反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，42 个循环；熔解曲线分析，95 ℃10 s，65 ℃5 s，每个样品设置3 个复孔，待测基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 wnt3a、β-catenin 蛋白表达检测 采用Western blot法。取大鼠胫骨近端骨组织约150 mg，液氮研磨后加入全细胞裂解液200 μL，涡旋混匀，冰上裂解30 min（间断涡旋3～5 次），4 ℃、15 000 r／min 离心15 min 后取上清提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取50 μg，加入适量5×loading buffer 混匀，进行10% （wnt3a）、8% （β-catenin）的SDS-PAGE 电泳，蛋白湿转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST 洗膜3 次，加入wnt3a、β-catenin、Tublin、GAPDH（1 ∶1 000 稀释） 一抗，4 ℃下孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入山羊抗兔（wnt3a、β-catenin、GAPDH）、山羊抗鼠（Tublin） 二抗，室温下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 法显影，图像处理软件分析各条带的灰度值。

2.7 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析或t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠骨密度 表2 显示，去卵巢3 个月后与假手术组比较，手术组大鼠骨密度显著降低（P＜0.05），表明造模成功。

表2 各组大鼠骨密度比较

表2 各组大鼠骨密度比较

注：与假手术组比较，*P＜0.05

组别 动物数／只 骨密度／（g·cm-2）假手术组 12 0.251 8±0.011 7手术组 12 0.205 4±0.022 3*

3.2 补肾健脾活血方对大鼠骨密度和生物力学的影响 表

3 显示，药物干预3 个月后与假手术组比较，模型组骨密度、刚度、最大载荷显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾健脾活血方组三者显著升高（P＜0.05）。

3.3 补肾健脾活血方对wnt／β-catenin 信号通路基因的影响 表4 显示，与假手术组比较，模型组wnt2、lrp6 mRNA表达 差 异 无 统 计 学 意 义 （P ＞0.05）， wnt3a、 lrp5、 βcatenin、Runx2、osterix mRNA 表达显著降低 （P ＜0.05），OPN 基因表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，补肾健脾活血方组能显著提高前五者mRNA 表达（P＜0.05），显著降低后者mRNA 表达（P＜0.05）。

3.4 补肾健脾活血方对wnt3a、β-catenin 蛋白的影响 表5、图1 显示，与假手术组比较，模型组wnt3a、β-catenin蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾健脾活血方组能显著提高两者蛋白表达（P＜0.05）。

表3 补肾健脾活血方对大鼠骨密度和生物力学的影响

表3 补肾健脾活血方对大鼠骨密度和生物力学的影响

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 动物数／只 骨密度／（g·cm-2） 刚度／（N·mm-1） 最大载荷／N假手术组 9 0.237 6±0.016 6 397.13±77.32 147.78±20.90模型组 11 0.184 4±0.007 8* 248.81±27.82* 105.74±3.93*补肾健脾活血方组 10 0.194 7±0.007 6＃ 362.31±31.71＃ 182.23±41.58＃阿仑膦酸钠维D3 片（Ⅱ）组 12 0.216 6±0.023 4＃ 402.43±68.38＃ 192.18±12.62＃

4 讨论

中医把骨质疏松归于“骨痿” 范畴，认为肾虚是疾病发生的根本，而脾虚是促进因素，血瘀是病理机制［5］，临床治疗以补肾壮骨、健脾活血之法立方，大多以补肾健脾活血方为基础方加减使用，屡获良效［2-3，6］。补肾健脾活血方是广州中医药大学附属骨伤科医院协定方，是右归饮（ 《景岳全书》 ） 合苁蓉汤（ 《圣济总录》 ） 加减化裁而来，由补骨脂、淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣10 味药材组成，方中补骨脂补肾壮阳强骨，为君药，臣以淫羊藿、肉苁蓉、菟丝子增强其补肾助阳之效，佐以熟地、白芍滋阴 “阴中求阳”，使“阳得阴助而生化无穷”，黄芪补气健脾，丹参、当归补血活血通络，大枣和中，其中黄芪合当归补气生血，合大枣补中益气，合丹参理气活血，使全方补而不滞，滋而不腻，助阳而不伤阴，共奏补肾壮骨、健脾益气、活血通络之功效。本实验采用摘除双侧卵巢的方法建立大鼠绝经后骨质疏松症模型，并在造模3 个月后进行骨密度测定，确认造模成功，并证实补肾健脾活血方能有效提高腰椎骨密度，改善腰椎生物力学性能，提高腰椎刚度和最大载荷。

表4 补肾健脾活血方对wnt／β-catenin 信号通路基因的影响

表4 补肾健脾活血方对wnt／β-catenin 信号通路基因的影响

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 动物数／只 Wnt2 Wnt3a Lrp5 Lrp6 β-catenin OPN Runx2 osterix假手术组 9 1.06±0.48 1.09±0.51 1.17±0.18 1.12±0.71 1.07±0.23 1.01±0.15 1.01±0.12 1.09±0.21模型组 11 1.35±0.50 0.64±0.17*0.70±0.18*0.84±0.20 0.59±0.11*2.56±0.91*0.28±0.03*0.49±0.08*补肾健脾活血方组 10 2.58±0.85 1.49±0.22＃2.97±1.28＃0.66±0.01 1.42±0.15＃1.15±0.33＃1.76±0.59＃ 1.76±0.47＃阿仑膦酸钠维D3 片（Ⅱ）组 12 2.72±1.13 1.28±0.68 1.09±0.26 1.94±1.83 1.06±0.73 0.84±0.56＃2.03±0.31＃ 1.21±0.46

表5 补肾健脾活血方对wnt3a、β-catenin 蛋白表达的影响

表5 补肾健脾活血方对wnt3a、β-catenin 蛋白表达的影响

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 动物数／只Wnt3a／GAPDH β-catenin／Tublin假手术组 9 3.20±0.74 2.13±0.19模型组 11 1.39±0.14* 1.68±0.16*补肾健脾活血方组 10 2.98±0.85＃ 2.90±0.25＃阿仑膦酸钠维D3 片（Ⅱ）组 12 1.50±0.21 2.29±0.38

图1 各组wnt3a、β-catenin 蛋白表达

Wnt／β-catenin 属于经典wnt 信号通路［7］，在骨形成过程中起到重要作用［8］。Wnt 家族蛋白是一类分泌型糖蛋白，可调节成骨细胞分化［9-10］，它与细胞膜表面的Frizzled 受体及其共同受体lrp5／6 结合，激活细胞质内的蓬乱蛋白（Dishevelled，Dvl），能使GSK-3β 磷酸化活性降低，阻止βcatenin 降解，使其稳定在细胞质中并富集，稳定的βcatenin 转运入核，与TCF-4／LEF 转录因子结合，上调下游靶基因Runx2、osterix 等表达［11-12］。造模后3 个月，模型组lrp5、β-catenin 基因的转录水平无明显变化，但β-catenin蛋白表达明显降低［13］；造模后4 个月，模型组β-catenin 基因转录水平及蛋白表达均明显降低［14］；造模后6 个月，模型组wnt2、lrp6 基因表达无明显变化，而wnt3a、lrp5、βcatenin、Runx2、osterix 基因表达明显降低，表明Wnt／βcatenin 信号通路处于抑制状态。补肾健脾活血方干预后，可激活Wnt／β-catenin 信号通路，促进wnt3a、lrp5、β-catenin、Runx2、osterix 基因转录，提高wnt3a、β-catenin 蛋白表达，表明该方可通过调控Wnt／lrp5／β-catenin 来促进骨形成。另外，阿仑膦酸钠维D3 片（Ⅱ） 是治疗骨质疏松症一线药物的含氮双膦酸盐，主要作用机制是抑制骨吸收［15］，同时对成骨细胞分化和矿化也起到一定作用［16］。本实验发现它虽然对Wnt／β-catenin 信号通路无明显调控作用，但能明显提高成骨分化因子Runx2 表达，osterix 表达也亦有升高趋势，与前期报道结果一致［16］。

骨桥蛋白（OPN） 可由成骨细胞、破骨细胞、骨细胞分泌，介导破骨细胞的活化和与骨基质的黏附［17］，在绝经后骨质疏松症患者中其血清水平增高，与腰椎骨量丢失呈负相关［18-19］；在去卵巢大鼠中，造模后4、8、12 周其腰椎基因和蛋白表达均明显升高［20］；本实验发现，去卵巢大鼠造模后6 个月胫骨近端其基因表达明显升高，而补肾健脾活血方干预后明显降低，表明它可通过下调表达来抑制破骨细胞活化。

综上所述，补肾健脾活血方可提高绝经后骨质疏松症大鼠的腰椎骨密度和生物力学性能，其机制可能与调控wnt／lrp5／β-catenin 信号通路和OPN 表达有关。