杜银香， 张建伟， 胡泽华， 涂 星

（湖北民族大学医学部，湖北 恩施445000）

华中枸骨Ilex centrochinensis S.Y.Hu 又称针齿冬青，是冬青科冬青属植物，主要生长在海拔300～1 000 m 的山坡和灌木丛中，广泛分布于湖北恩施，其性味甘凉，具有清热解毒功效，药用部位主要为根和叶，其中后者在民间常被用来治疗烫火伤［1］，在其他地区也是制作苦丁茶的原料［2-4］。目前发现，华中枸骨叶中主要含有萜类、有机酸、黄酮类等成分［5-7］，其中黄酮类具有广泛生物活性，如抗氧化、抗癌、抗菌［8-11］等，但目前对该类成分的研究较少，并且尚未涉及其提取工艺和抑菌作用。因此，本实验在单因素试验基础上采用Box-Behnken 响应面法优化华中枸骨叶总黄酮超声提取工艺，同时考察其抑菌作用，以期为该药材相关研究提供依据。

1 材料

1.1 试药 华中枸骨叶采自湖北省恩施市建始县，经湖北民族大学医学部胡泽华博士鉴定为冬青科冬青属植物华中枸骨Ilex centrochinensis S.Y.Hu 的叶，烘干后粉粹，过60目筛。芦丁对照品（上海金穗生物科技有限公司）。MH 琼脂、MH 肉汤（杭州微生物试剂有限公司）；金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、宋内志贺菌为湖北民族大学医学部微生物实验室保存菌种。亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、无水乙醇均为国产分析纯。

1.2 仪器 SSW 微电脑电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；NU-425-400S 生物安全柜 （美国NuAire 公司）；DFY-1000C 高速万能粉粹机（无锡沃信仪器有限公司）；CL-32 L 高压蒸汽灭菌器（日本ALP 公司）；THC-10B 数控超声波提取机（济宁天华超声电子仪器有限公司）；ELJ-2800R 紫外可见分光光度计（上海昂拉仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含有量测定

2.1.1 供试品溶液制备 称取药材粉末适量，25 ℃下按液料比10 ∶1 加入60%乙醇，置于超声波提取机（功率480 W） 中提取10 min，提取液过滤，滤渣在相同条件下再提取1 次，合并2 次滤液，离心、浓缩，加水定容，即得。

2.1.2 线性关系考察［12］配制0.1 mg／mL 芦丁对照品溶液，分别取0、1、2、3、4、5 mL 于10 mL 量瓶中，加30%乙醇至5 mL，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入1 moL／L 氢氧化钠4 mL，加水定容至10 mL，摇匀，放置15 min，于510 nm 波长处测定吸光度。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得到方程为A ＝10.17X ＋0.015 3 （R ＝0.999 7）， 在 0.010 ～0.050 mg／mL范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 取对照品溶液，按“2.1.2” 项下方法测定6 次，测得吸光度RSD 为0.19%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 取供试品溶液，按“2.1.2” 项下方法显色后于0、15、30、45、60、75 min 测定，测得吸光度RSD 为1.22%，表明溶液在75 min 内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验 精密称取药材粉末6 份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2” 项下方法测定，测得吸光度RSD 为1.11%，表明该方法重复性好。

2.1.6 加样回收率试验 精密量取总黄酮含有量已知的供试品溶液6 份，加入对照品溶液，按“2.1.2” 项下方法测定，测得芦丁平均加样回收率为99.78%，RSD 为1.35%。

2.1.7 测定方法 精密吸取总黄酮提取液适量， 按“2.1.2” 项下方法显色测定，平行3 次，取平均值，计算含有量，公式为含有量＝CNV／M（C 为提取液质量浓度，N为稀释倍数，V 为提取液定容体积，M 为药材粉末质量）。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数 固定提取时间10 min，液料比10 ∶1，加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇，测定总黄酮含有量，结果见图1。由图可知，乙醇体积分数在40%～60%范围内总黄酮含有量逐渐提高，60%时最高，但进一步增加后反而下降，这是因为乙醇体积分数升高，其极性也会随之改变，根据相似相溶原理，从药材中溶出的总黄酮量也会有所变化，同时醇溶性杂质溶出量也会增加，会与总黄酮竞争性地与乙醇-水分子结合，导致后者溶解度降低，含有量下降［13］。因此，确定最佳乙醇体积分数为60%。

图1 乙醇体积分数对总黄酮含有量的影响

2.2.2 液料比 固定乙醇体积分数60%， 提取时间10 min，选择液料比5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1，测定总黄酮含有量，结果见图2。由图可知，当液料比小于20 ∶1 时，随着乙醇用量增加总黄酮含有量逐渐升高，在20 ∶1 时最高，但随着乙醇用量进一步增加变化不明显，可能是一开始植物细胞内外总黄酮质量浓度差变大，有利于其溶出［14］，但当液料比为20 ∶1 时植物细胞中该成分已经被较完全地提取出来，故再增加乙醇用量其含有量也无明显提高［15］，而且会提高生产成本。因此，确定最佳液料比为20 ∶1。

2.2.3 提取时间 固定乙醇体积分数60%，液料比20 ∶1，提取10、20、30、40、50 min，测定总黄酮含有量，结果见图3。由图可知，随着提取时间延长，总黄酮含有量先升后降，在20 min 时最高，但随着其进一步延长反而下降，可能与提取时间过长破坏了黄酮中某些结构有关［16］。

图2 液料比对总黄酮含有量的影响

因此，确定最佳提取时间为20 min。

图3 提取时间对总黄酮含有量的影响

2.3 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C） 为影响因素，总黄酮含有量为（Y） 评价指标，设计3 因素3 水平试验。因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计及结果

通过Design-Expert 8.0.6.1 软件对表2 数据进行分析，得到 方程为Y ＝50.68-2.36A ＋3.46B ＋2.52C-1.16AB-0.25AC＋1.21BC-2.85A2-0.12B2-1.13C2，方差分析见表3。由表可知，模型P ＜0.000 1，极显著，而失拟项P ＞0.05，不显著，表明模型拟合度良好；决定系数R2＝0.992 4，校正后表明模型能解释98.27%的响应值变化；总变异系数CV ＝1.06%，表明试验可信度和精确度高［17］；A、B、C、AB、BC、A2、C2差异显著（P＜0.05），其他项不显著（P＞0.05），各因素影响程度依次为B＞C＞A。

表3 方差分析

响应面分析［18-19］见图4，可知乙醇体积分数和液料比、液料比和提取时间之间交互作用有明显影响。

2.4 验证试验 利用Design-Expert 8.0.6.1 软件的优化功能，得到最优工艺为乙醇体积分数为53.40%，液料比25 ∶1，提取时间30 min，总黄酮含有量为57.86 mg／g，为了操作方便，将乙醇体积分数调整为55%，其他条件不变。然后，进行3 批验证试验， 测得平均总黄酮含有量为57.81 mg／g，与预测值57.86 mg／g 接近，表明模型拟合度良好。

图4 各因素响应面图

2.5 抑菌试验 采用牛津杯法［20］。取0.1 mL 菌液（1×107cfu／mL） 均匀涂布在90 mm MH 琼脂培养基上后，将5个牛津杯均匀放置在涂菌后的平板上，各加入药液200 μL，以无菌水为阴性对照，庆大霉素为阳性对照。将平板放入37 ℃培养箱中培养18 h 后观察，重复3 次，取平均值，结果见表4、图5。由此可知，优化工艺下得到的总黄酮提取液对常见细菌均有抑制作用，而且随着总黄酮质量浓度的提高抑菌圈直径逐渐增大。

表4 总黄酮提取液对细菌的抑制作用（mm，n＝3）

表4 总黄酮提取液对细菌的抑制作用（mm，n＝3）

供试菌种 50总黄酮／（2 m 5 g· mL-1）12.5阳性对照 阴性对照金黄色葡萄球菌 21.50±0.50 20.00±0.50 18.50±0.66 28.73±0.21 —大肠埃希菌 14.58±0.95 13.00±0.50 11.25±0.25 28.33±0.24 —铜绿假单胞菌 12.33±0.29 11.50±0.50 11.00±0.50 28.83±0.62 —宋内志贺菌 10.00±0.00 — — 24.50±0.41 —

图5 总黄酮提取液对细菌的抑制作用

3 讨论

在优化工艺（提取温度25 ℃，超声功率480 W，乙醇体积分数55%，液料比25 ∶1，提取时间30 min，提取次数2 次） 下，华中枸骨叶总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、宋内志贺菌有一定抑制作用，并呈浓度依赖性。近年来随着抗生素大量不合理使用，耐药菌株越来越多，但细菌对有抗菌作用中草药产生耐药性的速度慢于对抗生素的，而且容易消失［21］，故本实验也可为临床上防止菌株产生耐药性提供新思路。