车尔玺， 邵志宇

（厦门大学附属第一医院药剂科，福建 厦门361000）

60Co-γ 射线辐照灭菌因其操作方便、灭菌效率高、且具有常温常压、穿透力强的特点，多用于中药材原生粉或原生粉直接制成片剂或胶囊剂灭菌［1-5］。肚液散为厦门大学附属第一医院院内制剂，是厦门已故名医周慕卿祖传秘方， 方由甘草、怀山药、 麦芽、 鸡内金、 灰香散等药味组成，用于治疗消化不良、食欲不振、肠鸣腹泻，疗效显著［6-8］。该品种亦采用辐射灭菌法保证药品质量。较大辐照剂量保证了好的灭菌效果，但辐照剂量过大，影响药品中某些化学成分，改变中药物质成分群的构成，从而影响复方制剂的安全性和有效性［1］。有较多研究报道60Co-γ 射线辐照灭菌对中药成分稳定性有影响，但报道中大多只考察了中药复方制剂中某些已知成分［9-11］。中药复方制剂通过多组分、多靶点协同起效，仅考察个别组分很难反映其整体质量。指纹图谱技术具有整体性、特征性的特点，能够较全面反映中药复方制剂的物质基础，用于中药复方制剂的辐照灭菌技术研究可以更全面、 客观进行评价［12-14］。本研究采用UPLC 建立了中成药肚液散的指纹图谱，确定了共有指纹峰，并对甘草苷、甘草酸及异甘草素进行含有量测定。通过比较不同60Co-γ 射线辐照剂量对肚液散化学成分稳定性的影响，确定合适的60Co-γ 射线辐照剂量，以期为该药物的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters UPLC 超高效液相色谱仪（包括QSM 二元溶剂管理器、PDA 二极管阵列检测器、SM-FTN、样品管理器、CH-A 型柱温箱，美国Waters 公司）；数控超声波清洗器KQ-100DE 型（昆山市超声仪器公司）； GTR16-2 高速离心机（北京时代北利离心机有限公司）；分析天平（丹佛仪器北京有限公司）。

1.2 材料 甘草苷（批号111610-201106，含有量93.1%）、甘草酸铵 （批号111610201106110731-201418，含有量93.1%） 均购于中国食品药品检定研究院； 异甘草素 （批号30518， 含有量≥94%） 购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘草药材（批号171024） 购于鹭燕医药公司（内蒙古）；麦芽药材（批号171002） 购于鹭燕医药公司（浙江）；山药药材（批号170913） 购于鹭燕医药公司（河南）；灰香散（批号M171004） 自制中间品；色谱级乙腈、甲醇（德国Merck 公司）；磷酸（上海化学试剂总厂）。

13 批未接受辐射肚液散成品， 批号分别为170503、 170504、 170505、 170506、 170510、170512、 170515、 171003、 171004、 171101、171105、180401、180402，取批号为180401 肚液散，保存未辐射母样，将样品分成2 份，分别为接受60Co-γ 射线辐射剂量为4、8 kGy，每种剂量平行4 份。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相乙腈-水（含0.05%磷酸） 梯度洗脱，程序见表1；柱温25 ℃；体积流量0.18 mL／min；检测波长237 nm；进样量1 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取甘草苷、甘草酸铵、异甘草素对照品适量，用70%甲醇配成质量浓度分别为1.41、0.954、0.415 mg／mL 的贮 备 液， 精 密 量 取 适 量， 制 成0.141、 0.477、0.041 5 mg／mL对照品溶液。甘草酸质量＝甘草酸铵质量／1.020 7［15］。

2.1.3 供试品溶液制备 称取肚液散粉末2.4 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中， 加入70%甲醇20 mL，精密量取，超声30 min，放冷，用70%甲醇补足减失质量，离心（5 000 r／min） 5 min，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.4 参照峰选择 在肚液散指纹图谱中，甘草酸（峰号15） 分离度好，峰面积较大，故选作参照峰。

2.1.5 精密度试验 称取肚液散（批号170515）粉末2.4 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样6 次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间RSD＜0.44%，相对峰面积RSD＜2.05%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取肚液散（批号170515） 粉末2.4 g，精密称定，平行6 份，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间RSD ＜1.58%，相对峰面积RSD＜2.61%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取肚液散（批号170515） 粉末2.4 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下，分别于0、1.5、4、8、12 h 进样，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间RSD＜0.79%，相对峰面积RSD＜2.74%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.8 指纹图谱建立 按“2.1.3” 项下方法制备未辐射的13 批样品，在“2.1.1” 项色谱条件下测定，导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012 版）。选取S1 作为参照图谱，时间窗设定为0.5，采用中位数法生成对照指纹图谱，见图1。13 批样品指纹图谱见图2，一共确定了22 个共有峰，其中5、13、15 号峰分别为甘草苷、异甘草素、甘草酸。采用夹角余弦法计算相似度，13 批样品的相似度结果见表2，相似度大于0.93。

图1 各成分对照指纹图谱Fig.1 HPLC reference spectrum of various constituents

图2 13 批未辐射样品UPLC 指纹图谱Fig.2 UPLC Fringerprints of thirteen batches of samples without 60Co-γ irradiation

2.2 含有量测定

2.2.1 线性关系考察 取“2.1.2” 项下甘草苷对照品溶液 （0.141 mg／mL）， 依次稀释1.25、2.5、5、10、20 倍，得到6 个质量浓度的对照品溶 液。 取 “2.1.2” 项 下 甘 草 酸 对 照 品 溶 液（0.477 mg／mL）依次稀释2、4、5、10、20 倍，得到6 个质量浓度的对照品溶液。取异甘草素对照品溶液（0.041 5 mg／mL），依次稀释1.25、2.5、5、10、20 倍，得到6 个质量浓度的对照品溶液。精密吸取上述溶液各1 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 13 批未辐射样品相似度Tab.2 Similarity of thirteen batches of samples without 60Co-γ irradiation

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.2 精密度试验 取肚液散（批号170515） 粉末2.4 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样6 次，测得甘草苷、甘草酸、异甘草素峰面积RSD 分别为0.74%、0.21%、1.39%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取肚液散（批号170515） 粉末2.4 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，测得甘草苷、甘草酸、异甘草素峰面积RSD 分别为1.78%、1.25%、2.74%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取肚液散（批号170515） 粉末2.4 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，分别在0、1.5、4、8、12 h 进样，测得甘草苷、甘草酸、异甘草素峰面积RSD 分别为1.42%、1.81%、2.37%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验 取已知含有量的样品（批号170515）6 份，每份2.4 g，精密称定，按各成分已知含有量的100%水平分别精密加入甘草苷、甘草酸、异甘草素对照品，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，得甘草苷、甘草酸、异甘草素平均加样回收率分别为102.5%、101.3%、98.01%，RSD 分别为1.74%、1.12%、1.89%。

2.2.6 样品含有量测定 取13 批肚液散粉末2.4 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，分别吸取1 μL 供试品溶液及对照品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，按照外标法计算含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果Tab.4 Results of content determination of various constituents

2.360Co-γ 对3 种成分的影响 选择批号为180401 的肚液散，分别给予4、8 kGy 不同剂量60Co-γ射线进行辐照灭菌，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样，获得指纹图谱，每个剂量水平重复4 次，采用外标法计算指纹图谱中的甘草苷、甘草酸、异甘草素含有量，结果见表5。采用SPSS 16.0 软件，双边t 检验对辐射前后2 组数据进行比较，具有显著性差异（P＜0.05），结果见表6。同时将不同辐照剂量下获得的肚液散液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012 版），结果见表7。

表5 不同 60Co-γ 射线辐射剂量下各成分含有量测定结果（n＝4）Tab.5 Results of content determination of various constituents with different doses of 60Co-γ radiation（n＝4）

表6 t 检验显著性概率值（n＝4）Tab.6 Significant probability by t-test（n＝4）

表7 不同辐射剂量样品相似度Tab.7 Similarities of samples with different doses of 60Co-γ irradiation

从表5 ～6 看出，在不同辐照剂量下，甘草酸和异甘草素含有量较为稳定，辐照前后含有量变化并无显著性差异（P＞0.05），甘草苷随着辐照剂量增加，含有量有所下降，当辐照剂量从4 kGy 增至8 kGy 时，含有量明显下降P＜0.05）。此外，同一辐照剂量水平下，异甘草素含有量RSD 5.870%～16.46%，变化较大，这是由于异甘草素峰面积小，受仪器噪音干扰较大。以60Co-γ 射线辐照肚液散，各样品指纹图谱相似度均在0.94 以上，且无共有指纹峰消失，表明大部分成分在4、8 kGy 的辐照剂量下较为稳定。

3 讨论

本研究先后分析了乙腈-水、 甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-乙酸乙酸铵缓对、乙腈-0.1%磷酸等多个流动相系统，最终确定乙腈-0.05%磷酸分离效果较好，峰信息量较大。同时，根据DAD 全波长扫描结果，在237 nm 波长下，特征峰响应较高，色谱图基线噪音较低，反映的信息量较大，确定237 nm 为检测波长。

22 个共有指纹峰多为未知成分，且对照品不易获得。但与单味药材在相同液相条件下获得的色谱图比较保留时间及紫外特征吸收光谱信息，初步确定22 个共有峰多来自甘草。肚液散由甘草、麦芽、山药、灰香散等组成，为建立更加完善的肚液散质量评价系统，下一步将补充肚液散气相指纹图谱，从而获得更加全面的组分信息，更好控制产品质量。

以未辐照样品的指纹图谱作为参照，不同辐照剂量下样品得到的指纹图谱与对照指纹图谱采用相似度评价系统进行比较，相似度均大于0.94，表明在4、8 kGy 的辐照剂量下，肚液散的化学稳定性较好。采用外标法测定肚液散中甘草苷、甘草酸、异甘草素的含有量，通过t 检验方法比较3 种成分在不同辐照剂量下含有量变化情况，发现甘草苷在较高辐照剂量下， 含有量下降显著 （P ＜0.05），而甘草酸和异甘草素在不同辐照剂量下均较稳定。60Co-γ 射线产生的能量能够使肚液散中某些重要成分发生变化，对稳定性较差的成分含有量有影响。因此选择60Co-γ 射线进行辐照灭菌时，在保证灭菌效果前提下，照射剂量选择低剂量。