黄文涛， 周 进*， 王贵玉

（1.武汉市第一医院药学部，湖北武汉430000；2.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤科，黑龙江哈尔滨150040）

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势［1］，发病率在恶性肿瘤中排名第4 位，死亡率居第5 位［2］。手术、放疗、化疗为结直肠癌主要治疗方式，但毒副作用较大，预后效果不佳［3］，故寻找毒副作用较小的高效药物具有重要意义。

槲皮素是一种存在于车前子、紫花地丁等多种中药中的黄酮类化合物，具有抗菌消炎、保护心血管、抗肿瘤等作用［4］，能诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，延长细胞周期，调节肿瘤相关基因表达，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种恶性肿瘤中发挥抑制作用［5-7］。Avinaba 等［8］发现，槲皮素可通过调节STAT3 信号通路来诱导非小细胞肺癌A549 细胞凋亡；Yang 等［9］报道，槲皮素可通过调节Akt／c-Myc 信号通路来诱导结直肠癌HT-29 细胞凋亡，使细胞周期停滞，从而抑制细胞增殖，但尚无关于槲皮素调控STAT3 表达来影响结直肠癌SW620 细胞迁移、侵袭的报道。因此，本实验观察槲皮素对SW620 细胞活力、迁移、侵袭的抑制作用，以及对STAT3 表达的影响，探讨相关作用机制。

1 材料

人正常结肠上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞SW620 购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。胎牛血清、RPMI-1640 培养基、二甲基亚砜（DMSO） 购自美国Gibco 公司；槲皮素、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；BCA 试剂盒、PBS缓冲液、 MTT 试剂盒购自美国 Sigma 公司；Transwell 小 室 购 自 美 国Corning 公 司； β-actin、STAT3 一抗购自英国Abcam 公司；HRP 二抗购自上海碧云天生物科技公司； Trizol 试剂、Lipofectamine TM 2000、SDS-PAGE 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；TaKaRa 反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自宝生物工程 （大连） 有限公司；PVDF 膜购自美国Millipore 公司；ABI-7300 实时荧光定量PCR 仪购自上海普迪生物技术有限公司；NanoDrop 微量核酸测定仪购自美国赛默飞世尔科技公司；凝胶成像分析仪购自柯达公司。

2 方法

2.1 细胞培养及转染 含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基于37 ℃、5% CO2下培养NCM460、SW620 细胞，每2 d 换液1 次，细胞汇合度达到80%后用0.25% 胰酶消化并传代，待细胞生长状态稳定后取对数生长期细胞用于后续实验。收集汇合度约50%的SW620 细胞，按照Lipofectamine TM 2000 转染试剂说明书分别加入转染试剂Lipofectamine 与 si-NC、 si-STAT3、 pcDNA、STAT3，并依次标记为si-NC 组、si-STAT3 组、槲皮素＋pcDNA 组、槲皮素＋STAT3 组。

2.2 给药及分组 DMSO 溶解槲皮素， 配成20 mmol／L贮备液，于-20 ℃下保存，使用时用RPMI-1640 培养液稀释，用于细胞培养。将其加入到SW620 细胞培养液中，槲皮素终浓度分别为0、25、50、100 μmol／L，重复5 次，各组细胞置于细胞培养箱中，37 ℃、5% CO2下常规培养24 h，50 μmol／L槲皮素处理的细胞分别培养0、24、48、72 h，每组重复5 次。

2.3 细胞存活率检测 采用MTT 法。取槲皮素0 μmol／L 组、 25 μmol／L 组、 50 μmol／L 组、100 μmol／L组，si-NC 组，si-STAT3 组细胞，在转染后的槲皮素＋pcDNA 组和槲皮素＋STAT3 组细胞培养液中加入槲皮素，调整终浓度为50 μmol／L。培养24 h 后，各组细胞加入20 μL MTT 孵育4 h，弃去培养基， 每孔加150 μL DMSO， 振荡溶解10 min，酶标仪检测490 nm 波长处各孔光密度（OD） 值，计算存活率，公式为存活率＝ （实验组OD 值／对照组OD 值） ×100%。

2.4 细胞迁移和侵袭检测 采用Transwell 法。各组细胞加入2.5 μg／mL 丝裂霉素C 干预24 h 以抑制细胞分裂，培养结束后加入适量胰酶消化，PBS缓冲液清洗后用无血清培养基重悬细胞，调整密度为3×104／mL，取200 μL 接种于包被、未包被基质胶的小室中，放到含完全培养基的下室中常规培养24 h，弃去多余培养基，PBS 缓冲液洗涤后加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并随机选取6 个视野拍照，计数。

2.5 STAT3 mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。收集各组对数生长期的细胞，充分研磨后加入Trizol 试剂提取总RNA，NanoDrop 微量核酸测定仪检测RNA 纯度和浓度，凝胶电泳系统检测RNA 完整性。 TaKaRa 反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin 为内参，置于ABI-7300 实时荧光定量PCR 仪上进行扩增，每个样品重复3次，引物序列见表1，采用2-ΔΔCt法进行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 STAT3 蛋白表达检测 采用Western blot 法。各组细胞超声粉碎后，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解5 min，4 ℃、12 000 r／min 离心15 min，收集上清，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。取50 μL 进行SDS-PAGE 电泳， 结束后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉PBST 封闭2 h，加入稀释过的βactin 或STAT3 单克隆抗体，一抗于4 ℃下孵育过夜，PBST 漂洗3 次，加入HRP 标记的二抗室温孵育2 h，PBST 漂洗3 次，ECL 试剂显色，凝胶成像系统拍照。每个样品重复3 次。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（表示，组间比较采用单因素方差分析和SNK-q 法，不同时间点数据比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 槲皮素对SW620 细胞存活率的影响 图1 显示，与对照组（0 μmol／L） 比较，50、100 μmol／L槲皮素处理后细胞存活率显著降低（P＜0.05），考虑到成本方面，选择50 μmol／L；与对照组（0 h）比较，50 μmol／L 槲皮素处理24、48、72 h 后其存活率也显著降低（P＜0.05，P＜0.01），考虑到效率方面，选择48 h。

图1 槲皮素对SW620 细胞存活率的影响Fig.1 Effect of quercetin on the survival rate of SW620 cells

3.2 槲皮素对SW620 细胞迁移、侵袭的影响 图2 显示，50 μmol／L 槲皮素处理48 h 后，细胞迁移数目、侵袭数目较对照组（0 μmol／L） 显著降低（P＜0.05）。

图2 槲皮素对SW620 细胞迁移、侵袭的影响Fig.2 Effects of quercetin on the migration and invasion of SW620 cells

3.3 槲皮素对STAT3 mRNA 表达的影响 图3 显示，与NCM460 细胞组比较，SW620 细胞组STAT3 mRNA 表 达 显 著 上 调 （P ＜0.01）； 与 对 照 组（0 μmol／L） 比较，50、100 μmol／L 槲皮素处理后其mRNA 表达显著下调 （P ＜0.05）； 与对照组（0 h） 比较，处理24、48、72 h 后其mRNA 表达也显著下调（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 槲皮素对STAT3 mRNA 表达的影响Fig.3 Effect of quercetin on STAT3 mRNA expression

3.4 敲低STAT3 对SW620 细胞存活率、迁移、侵袭的影响 图4 显示，敲低STAT3 后其蛋白表达显著下调（P＜0.05）；与si-NC 组比较，si-STAT3 组细胞存活率、迁移数目、侵袭数目显著降低（P＜0.05）。

图4 敲低STAT3 对SW620 细胞存活率、迁移、侵袭的影响Fig.4 Effects of knockdown of STAT3 on the survival，migration and invasion of SW620 cells

3.5 过表达STAT3 对SW620 细胞存活率、迁移、侵袭的影响 图5 显示，与对照组比较，槲皮素组STAT3 蛋白表达显著下调（P ＜0.05），而过表达STAT3 后槲皮素＋STAT3 组蛋白表达显著上调（P＜0.05）；槲皮素组细胞存活率、迁移数目、侵袭数目显著降低（P＜0.05），而过表达STAT3 后槲皮素＋STAT3 组生存、迁移、侵袭能力显著增强（P＜0.05）。

图5 过表达STAT3 对SW620 细胞存活率、迁移、侵袭的影响Fig.5 Effects of overexpression of STAT3 protein expression on the survival， migration and invasion of SW620 cells

4 讨论

结直肠癌发生与年龄、性别、遗传等多种因素有关，我国结直肠癌患者主要为中老年人，其中男性居多［10］。目前，手术是主要治疗手段，辅以放疗、化疗，但对患者毒副作用较强，影响患者预后生活质量。研究显示，中药在结直肠癌治疗中能提高机体免疫力，减轻放疗、化疗引起的不良反应，提高预后生存率［11］。

槲皮素在肿瘤细胞中能阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡［12］，例如在肺癌细胞中通过抑制极光激酶B（Aurora B） 活性来抑制肿瘤生长［13］；在胃癌细胞中通过调节基质金属蛋白酶、核转录因子-κB、细胞外调节蛋白激酶（ERK1／2） 表达来抑制细胞迁移和侵袭，发挥抗肿瘤转移的作用［14］；在胶质母细胞瘤细胞中通过调节STAT3 表达来抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭［15］；在结直肠癌的研究中不仅能通过调节Akt／c-Myc 信号通路来诱导细胞凋亡，抑 制 细 胞 增 殖［9］， 还 能 通 过 调 节Wnt／βcatenin 信号通路来延长细胞周期， 抑制细胞凋亡［16］。本实验发现，槲皮素能呈剂量、时间依赖性地抑制SW620 细胞存活率、 迁移、 侵袭， 以50 μmol／L下处理48 h 效果最佳，同时也能呈剂量、时间依赖性地抑制STAT3 表达。

STAT3 是信号转导与转录活化因子（STAT）家族的一员，能调节与细胞周期、免疫应答等相关基因的表达，并参与血管生成、细胞增殖、凋亡等生物过程， 是JAK／STAT 信号通路中的重要因子［17-18］，存在于多种肿瘤细胞中，激活时能抑制癌 细 胞 凋 亡， 促 进 肿 瘤 发 生［19］。 研 究 表 明，STAT3 能通过靶向Bcl-2、Bcl-xl、细胞周期蛋白D1 等下游靶基因来调节乳腺癌肿瘤的生长［20］，敲除STAT3 能抑制Bcl-2、Bcl-xl 表达，诱导卵巢癌细胞凋亡［21］；干扰STAT3 表达能促进结直肠癌细胞凋 亡， 抑 制 细 胞 侵 袭［22-23］； Zhang 等［24］报 道，激活STAT3 信号传导途径能增强结直肠癌细胞生长、转移， 促进肿瘤发生。 本实验发现， 敲低STAT3 能抑制SW620 细胞存活、迁移、侵袭，与前期报道［22-24］一致；槲皮素处理后，STAT3 蛋白表达明显下调，细胞存活率、迁移和侵袭能力明显减弱，过表达STAT3 能逆转槲皮素对SW620 细胞迁移、侵袭的抑制作用。

综上所述，槲皮素能抑制SW620 细胞存活、迁移、侵袭， 其机制可能与抑制SW620 细胞中STAT3 表达有关，表明槲皮素可能对结直肠癌发生发展具有抑制作用，可为相关深入研究提供实验基础。