冯庆涛， 杨 静， 张 燕， 吕尚增， 苗华为

（河北省中医院，河北 石家庄050011）

慢性心衰是由多因素所致的病理过程［1］，传统中医药在治疗过程中显示出整体辨证和调节的独特优势。补益强心片是由人参、黄芪、五加皮等组成的复方中药制剂，临床上用于治疗冠心病、高血压性心脏病所致慢性充血性心力衰竭［2-3］，并在《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》 中推荐用于慢性心衰患者的治疗。

PI3K-Akt 信号通路是与细胞生长、增殖密切相关的一条典型信号转导通路，激活后可抑制细胞凋亡，改善心脏功能［4］。本实验通过结扎心脏左冠状动脉前降支的方法制备慢性心力衰竭大鼠模型，观察补益强心片对其作用，并初步探讨该制剂对PI3K-Akt 信号通路及凋亡的影响，从而为其临床用药提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 雄性SD 大鼠60 只，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京） 2016-0011。实验期间大鼠于笼中饲养，每笼5 只，每天光照12 h，温度20 ～26 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2 试药 补益强心片购自苏州滋露药业有限公司（国药准字Z20050077）。大鼠N-端前脑钠肽（BNP）、大鼠N-端前心钠肽 （ANP） 酶联免疫（ELISA） 试剂盒购自上海易利生物科技有限公司；B 细胞白血病／淋巴瘤抗原-2（Bcl-2）、白血病／淋巴瘤抗原相关X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase-3）、磷脂酰肌醇-3 羟基激酶（PI3K） 及磷酸化（p-PI3K）、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Akt） 及磷酸化（p-Akt） 兔多克隆抗体均购自英国Abcam 公司。

1.3 仪器 POWERLAB-420E 生理记录仪购自澳大利亚ADInstruments 公司；HX-300 动物呼吸机购自成都泰盟科技有限公司；小动物超声仪超声诊断系统购自意大利百胜集团公司；Epics XL 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter 公司；SpectraMax M2酶标仪购自美国分子仪器公司；ABI 300 荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司。

2 方法

2.1 分组及给药 60 只大鼠随机为正常对照组、假手术组、模型组及补益强心片低、中、高剂量组（0.18、0.36、0.72 g／kg）， 每组10 只。 手术后24 h开始给药，补益强心组大鼠每天灌胃给药，持续4 周，药物分别用纯水配制成0.018、0.036、0.072 g／mL 混悬液，而正常对照组、假手术组、模型组大鼠灌胃给予等体积纯水，各组给药量均为1 mL／100 g。

2.2 模型建立［5］大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰卧位固定，连接生理记录仪，经口气管插管，连接动物呼吸机，打开胸腔，第2、3 肋骨之间钝性分离胸膜，在左心耳下与肺动脉根部约1.5 mm 处迅速穿线结扎左冠状动脉前降支，关闭胸腔后缝合，生理记录仪可观察到ST-T 弓背上抬，提示造模成功；假手术组大鼠只穿线而并不结扎；正常对照组大鼠不作任何处理。

2.3 血流动力学参数检测 给药结束后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，仰卧位固定，备皮，应用超声仪超声诊断系统，二维超声引导，根据心室波群的M 型曲线测量大鼠左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）、射血分数（LVEF）。

2.4 BNP、ANP 水平检测 采用ELISA 法。大鼠颈动脉取血，离心后取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书步骤操作， 酶标仪测定OD 值， 计算BNP、ANP 水平。

2.5 心肌细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取大鼠心脏左室壁心肌组织，剪碎后充分研磨，PBS缓冲液洗涤， 加入膜联蛋白 V 和碘化丙啶（Annexin V-PI） 进行联合染色，混匀后置于冰浴中温育，上机检测凋亡率，流式细胞仪激发光波长为488 nm。

2.6 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。取大鼠心脏左室壁心肌组织，加入Trizol Reagent 冰浴匀浆，离心，提取总RNA，按试剂盒要求进行反转录，加入引物等反应体 系， PCR 仪 扩 增。 Bcl-2 正 向5′-GGATGACTTCTCTCGTCGCTAC-3′， 反 向5′-TGACATCTCCCTGTTGACGCT-3′，产物片段100 bp；Bax 正向5′-GGTTGCCCTCTTCTACTTTGC-3′， 反 向 5′-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3′， 产 物 片 段 239 bp；caspase-3 正向5′-GCGGTATTGAGACAGACAGTG-3′，反向5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′，产物片段95 bp； 内 参GAPDH 正 向5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′， 反 向 5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，产物片段143 bp。采用RT-PCR 自带的分析软件，将正常对照组设定为1，以目的基因／GAPDH 相对定量值反映目的基因表达。

2.7 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达检测 采用Western blot 法。取大鼠心脏左室壁心肌组织，加入预冷的组织裂解液充分匀浆，离心后取上清，BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳变性，将分离蛋白经转移装置转移至膜，PVDF膜在脱脂奶粉溶液中孵育， 加入一抗或内参GAPDH 进行抗原抗体结合，再加入相应二抗以结合一抗，采用化学发光法，X 胶片曝光显影，分析软件将扫描图片进行条带灰度值数字化，以Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、 p-PI3K、 Akt、 p-Akt 灰度值／GAPDH 灰度值来校正误差，所得比值反映目的蛋白相对表达。

2.8 统计学分析 通过SPSS 11.5 软件进行处理，数据以（） 表示，2 组间比较采用SNK-q 法，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 补益强心片对血流动力学参数的影响 表1、图1 显示， 与假手术组比较， 模型组LVEDd、LVESd 显著升高，LVEF 显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，补益强心片低剂量组LVESd 显著降低，LVEF 显著升高（P＜0.05，P＜0.01），中、高剂量组LVEDd、LVESd 显著降低，LVEF 显著升高（P＜0.01）。

表1 各组血流动力学参数比较（，n＝10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups（，n＝10）

表1 各组血流动力学参数比较（，n＝10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups（，n＝10）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1） LVEDd／mm LVESd／mm LVEF／%正常对照组 — 5.33±0.91 3.21±0.68 79.02±9.22假手术组 — 5.41±0.93 3.29±0.73 72.59±10.08模型组 — 7.89±1.14＃＃ 7.11±1.23＃＃ 35.16±7.39＃＃补益强心片低剂量组 0.18 6.79±1.18 5.91±0.97* 47.41±6.26**补益强心片中剂量组 0.36 6.28±0.93** 5.86±0.81* 53.87±7.08**补益强心片高剂量组 0.72 6.12±0.89** 5.15±0.77** 57.81±7.79**

3.2 补益强心片对BNP、ANP 水平的影响 表2显示，与假手术组比较，模型组BNP、ANP 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，补益强心片组两者水平显著降低（P＜0.01）。

图1 各组大鼠超声心电图Fig.1 Ultrasonic lectrocardiograms of rats in various groups

表2 各组BNP、ANP 水平比较（n＝10）Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups，n＝10）

表2 各组BNP、ANP 水平比较（n＝10）Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups，n＝10）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

组别 （g剂·k量g-／1） （n B g·NLP-／1） （n A g·NLP-／1）正常对照组 — 125.86±23.27 35.89±6.01假手术组 — 127.05±19.35 38.54±6.30模型组 — 265.57±30.72＃＃ 69.05±9.52＃＃补益强心片低剂量组 0.18 182.72±20.27** 52.84±8.87**补益强心片中剂量组 0.36 167.48±19.33** 49.27±8.59**补益强心片高剂量组 0.72 165.81±19.22** 48.89±7.08**

3.3 补益强心片对细胞凋亡率的影响 表3、图2显示，与假手术组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，补益强心片组其凋亡率显著降低（P＜0.01）。

表3 各组细胞凋亡率比较，n＝10）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn＝10）

表3 各组细胞凋亡率比较，n＝10）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn＝10）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1） 凋亡率／%正常对照组 — 5.23±1.11假手术组 — 6.01±1.08模型组 — 13.05±2.19＃＃补益强心片低剂量组 0.18 10.23±2.05**补益强心片中剂量组 0.36 9.44±1.38**补益强心片高剂量组 0.72 8.19±1.03**

3.4 补益强心片对Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响 表4～5、图3 显示，与假手术组比较，模型组Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 和蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，补益强心片组Bcl-2 mRNA 和蛋白表达显著升高，Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表达显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各组Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表达比较n＝5）Tab.4 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn＝5）

表4 各组Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表达比较n＝5）Tab.4 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn＝5）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1） Bcl-2 Bax caspase-3正常对照组 — 0.96±0.16 1.03±0.14 0.89±0.09假手术组 — 1.02±0.17 1.09±0.21 0.93±0.11模型组 — 1.21±0.18＃＃ 2.89±0.23＃＃ 3.01±0.37＃＃补益强心片低剂量组 0.18 1.55±0.21* 1.92±0.19** 2.19±0.21**补益强心片中剂量组 0.36 2.13±0.25** 1.69±0.17** 1.95±0.28**补益强心片高剂量组 0.72 2.91±0.28** 1.51±0.15** 1.68±0.19**

图2 各组大鼠细胞凋亡图Fig.2 Cell apoptosis maps of rats in various groups

表5 各组Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达比较（n＝5）Tab.5 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expressions among various groups（，n＝5）

表5 各组Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达比较（n＝5）Tab.5 Comparison of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expressions among various groups（，n＝5）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1） Bcl-2 Bax caspase-3正常对照组 — 0.34±0.06 0.29±0.04 0.41±0.05假手术组 — 0.36±0.07 0.22±0.03 0.45±0.07模型组 — 0.48±0.07＃＃ 0.93±0.20＃＃ 1.09±0.15＃＃补益强心片低剂量组 0.18 0.54±0.09 0.71±0.15** 0.79±0.11**补益强心片中剂量组 0.36 0.62±0.15* 0.66±0.12** 0.75±0.18**补益强心片高剂量组 0.72 0.71±0.13** 0.42±0.05** 0.60±0.08**

图3 各组大鼠心肌组织免疫印迹条带图Fig.3 Immunoblot band diagrams for rat myocardial tissues in various groups

3.5 补益强心片对p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 的影响 表6、图3 显示，与假手术组比较，模型组p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 显著降低（P ＜0.01）；与模型组比较，补益强心片组两者显著升高 （P ＜0.01）。

表6 各组p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 水平比较 n＝5）Tab.6 Comparison of p-PI3K／PI3K and p-Akt／Akt levels among various groups，n＝5）

表6 各组p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 水平比较 n＝5）Tab.6 Comparison of p-PI3K／PI3K and p-Akt／Akt levels among various groups，n＝5）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

组别 （g剂·k量g-／1） p-PI3K／PI3K p-AKT／AKT正常对照组 — 0.69±0.13 0.91±0.15假手术组 — 0.65±0.18 0.93±0.20模型组 — 0.21±0.04＃＃ 0.22±0.03＃＃补益强心片低剂量组 0.18 0.37±0.06** 0.42±0.05**补益强心片中剂量组 0.36 0.54±0.09** 0.66±0.12**补益强心片高剂量组 0.72 0.59±0.11** 0.71±0.15**

4 讨论

导致慢性心力衰竭的病因很多，其中心肌梗死所致心力衰竭是重要促发因素，发生率高达32%～48%［6-7］。本实验采用结扎心脏左冠状动脉前降支的方法制备急性心肌梗死大鼠模型，4 周后测定其心功能参数，发现心室腔扩大，心尖区或心前壁变薄，LVEDd、LVESd 明显升高，左室射血分数降低至45%以下，表明造模成功［8］。补益强心片由人参、黄芪、五加皮、丹参、麦冬、葶苈子组成［2］，其中人参具有大补元气、复脉固脱之功效［9］，黄芪具有益肾补血、泄虚补阳之功效，五加皮具有补中益精、坚筋骨之功效，葶苈子具有行水化痰、理肝顺气之功效，给予该制剂后大鼠心室腔明显缩小，LVEDd、LVESd 降低，射血分数升高，表明它能改善慢性心衰大鼠心功能。

心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP） 是心脏分泌的重要多肽类激素，在正常生理状态下机体少量分泌，而急性心肌梗死后心肌细胞会合成释放大量该激素，故检测两者水平对心力衰竭诊断、治疗、预后评估至关重要［10］，与慢性心衰严重程度密切相关［11］。本实验发现，慢性心力衰竭大鼠血浆中ANP、BNP 水平高于正常组2 倍以上，；给予补益强心片后，它能在很大程度上降低两者水平。

PI3K-Akt 信号通路是生命活动中的关键信号分子，也是许多效应分子（如胰岛素、生长因子等） 共用的信号转导通路，参与机体多种细胞生长、分化、凋亡等［12-13］，被认为是一条重要的内源性心肌肥大调节通路［14］，心肌梗死后缺血缺氧，诱导心肌细胞凋亡，平滑肌细胞异常增生，心脏正常结构及功能极大受损；PI3K 被激活后，能使其下游信号分子Akt 磷酸化为p-Akt，转膜至细胞核，发挥抑制细胞凋亡、促进生长、维持细胞生存等功能。本实验发现，补益强心片能降低细胞凋亡率，抑制凋亡因子Bax、caspase-3 表达，升高Bcl-2 表达，p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 比值升高， 表明它可激活PI3K-Akt 信号通路，抑制心衰后的心肌细胞凋亡及Bax、caspase-3 表达，上调Bcl-2 表达，从而发挥心肌保护作用。