陈 丹， 李 柯， 符国成， 侯 茜， 沈冰冰， 龚小兵， 李若存

［1.湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭411102；2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙410013；3.华润三九（郴州） 制药有限公司，湖南 郴州423000］

复方感冒灵颗粒由山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅6 味中药，以及对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏3 种西药组成的中西药复方制剂，用于治疗风热感冒及温病之发热、微恶风寒、头身痛、口干而渴、鼻塞涕浊、咽喉红肿疼痛、咳嗽、痰黄黏稠，疗效确切，市场需求量大，现有药品标准（国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS3-B-2384-97-2017） 定性采用TLC法鉴别其中对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏，滴定法测定对乙酰氨基酚含有量［1］，但对中药相关质量控制与药效物质基础的阐释仍为空白，导致质量有差异，药效不稳定，成为制约相关产业发展亟待解决的问题。

中药指纹图谱作为复方制剂质量控制及中药化学组分阐释的一种重要方法， 得到了广泛应用［2-8］。本实验建立复方感冒灵颗粒HPLC 指纹图谱，并对其色谱峰进行指认，鉴定出主要化学成分，以期为该制剂药效物质基础阐明和质量标准的制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 型高效液相色谱系统，配置6530Accurate-Mass Q-TOF-LC-MS／MS、Qualitative Analysis B.05.00 色谱处理软件（美国安捷伦科技公司）；KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XPE105 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 试药 对乙酰氨基酚 （批号 100018-201409）、咖啡因（批号171215-201211）、绿原酸（批号110753-201716）、原儿茶酸（批号110809-200604）、咖啡酸（批号110885-200102）、蒙花苷（批号111528-201710） 对照品均购自中国食品药品检定研究院； 异绿原酸 A （批号 MUST-18032601）、异绿原酸B（批号MUST-18031602）、新绿原酸（批号MUST-18031001）、隐绿原酸（批号MUST-18032403）、 异绿原酸C （批号MUST-18031603） 对照品均购自成都曼思特有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯（美国Tedia 公司）；甲酸为分析纯（长沙市汇虹化玻仪器设备有限公司）；水为怡宝纯净水。复方感冒灵颗粒由华润三九（郴州） 制药有限公司提供，共10 批，批号分别为1709026N、1709027N、1709028N、1806254N、1806255N、1806256N、 1806257、 1806258N、 1806259N、 1806260N，编号S1～S10。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，50%甲醇定容，即得，每1 mL 分别含对乙酰氨基酚2.6 mg、原儿茶酸10 μg、新绿原酸80 μg、绿原酸100 μg、咖啡因0.18 mg、隐绿原酸80 μg、咖啡酸5 μg、 异绿原酸B 40 μg、 异绿原酸A 20 μg、异绿原酸C 45 μg、蒙花苷100 μg。

2.2 供试品溶液制备 精密称取颗粒粉末9.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，称定质量， 超声 （功率250 W、 频率50 kHz）30 min，冷却，50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈 （A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～20 min，5%→18%A；20 ～45 min，18%→26%A；45 ～55 min，26%→35%A；55～60 min，35%→5%A；60 ～65 min，5%A）；检测 波 长 290 nm； 柱 温 30 ℃； 体 积 流 量1.0 mL／min；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 质谱条件 电喷雾电离源离子化（ESI），负离子模式采集；辅助喷雾电离、脱溶剂气体高纯N2；干燥气体积流量6.8 L／min；鞘气温度350 ℃；毛细管电压4.0 kV；碎片电压130 V；m／z 50 ～1 000。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取颗粒 （S1） 适量， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，以绿原酸保留时间、峰面积为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取颗粒 （S1） 适量， 按“2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取供试品（S1） 溶液，于0、3、6、9、12、15、24 h 在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6 HPLC 指纹图谱建立及相似度计算 取10 批颗粒，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统” 软件处理数据，选择S1 作为参照图谱，多点校正后自动匹配，生成对照图谱（R），由于绿原酸（4 号峰） 分离度较好，峰面积适中，对照品易得， 故将其作为参照峰（S），测定相对保留时间、相对峰面积，确定有11个共有峰。见图2，相似度见表1。

图2 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表1 10 批样品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

2.7 化学成分鉴定 通过对照品鉴定出11 种成分，分别为对乙酰氨基酚、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡因、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷。再通过HPLC-Q-TOF-MS／MS 法对指纹图谱色谱峰进行指认，比对精确相对分子质量、特征碎片峰，并结合Mass Fragment TM 确定相对分子质量和分子式，结合已建立的目标数据库和文献，鉴定出6 种成分，分别为奎尼酸、丁香酸、咖啡因、松柏醛、二咖啡酰奎尼酸、断氧化马钱子苷、毛冬青酸。见图3 ～4、表2。

图3 各成分HPLC-Q-TOF-MS／MS 负离子流图Fig.3 HPLC-Q-TOF-MS／MS anion current chromatogram of various constituents

图4 样品（S1） HPLC 指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprint of sample（S1）

2.8 药材归属 图4 中共有27 个色谱峰，通过比对相应对照品、指纹图谱，确定峰7 为奎尼酸，是五指柑特征峰；峰8 为丁香酸，是山银花特征峰；峰10 为原儿茶酸，是山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰11 为新绿原酸，是岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰13 为绿原酸，是岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰15 为隐绿原酸，是岗梅、三叉苦、山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰16 为松柏醛，是岗梅、南板蓝根、三叉苦、山银花、五指柑共有峰；峰17 为咖啡酸，是岗梅、五指柑、野菊花共有峰；峰18 为二咖啡酰奎宁酸，是南板蓝根、三叉苦、山银花、野菊花共有峰；峰21 为断氧化马钱子苷，是山银花特征峰；峰22 为毛冬青酸，是岗梅、南板蓝根、三叉苦、山银花、五指柑共有峰；峰24 为异绿原酸B，是岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰25 为异绿原酸A，是岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰26 为异绿原酸C，是岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有峰；峰27 为蒙花苷，是野菊花特征峰。见图5。

表2 主要共有峰HPLC-Q-TOF-MS／MS 分析Tab.2 HPLC-Q-TOF-MS／MS analysis of main common peaks

图5 样品与单味药HPLC 特征图谱Fig.5 Characteristic HPLC chromatograms of sample and single drugs

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了超声提取、回流提取，发现两者对测定结果无明显影响，故选择操作简便的前者，再比较了提取溶剂（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇）、溶剂用量（25、 50、 100 mL）、 提 取 时 间 （20、 30、40 min），综合考虑色谱峰数、分离度、对称因子、相对内参比峰面积和，最终确定供试品溶液制备方法为50 mL 50%甲醇超声提取30 min。

3.2 检测波长选择 本实验利用二极管阵列检测器全波长扫描，重点考察了245、256、260、273、290、325、330、334 nm 波长下的指纹图谱，综合考虑色谱峰数、分离度、相对内参比峰面积和，发现290 nm 处效果较好，故选择其作为检测波长。

3.3 流动相优化 由于复方感冒灵颗粒中野菊花、山银花等药材所含成分呈略偏酸性，故流动相也应略偏酸。文献［17-20］ 报道，山银花、野菊花中主要成分的HPLC 分离溶剂一般采用乙腈，而液质采用甲酸，故水相为0.1%甲酸。再选择5 种流动相比例来优化梯度洗脱条件，发现以“2.3” 项下流动相洗脱时基线较平稳，色谱峰分离良好，而且数量多，高度适中。

3.4 参照峰选择 现代研究表明，绿原酸具有抗菌、抗炎、抗氧化、补肾、保肝、抗高血压、抗肿瘤、抗辐射等多种药理作用［21］。图3 中13 号峰绿原酸为复方感冒灵颗粒中山银花、岗梅、五指柑、野菊花共有成分，其峰面积大小适中，与前后色谱峰分离度较好，而且保留时间稳定，故选择其作为参照峰。

4 结论

中药指纹图谱既能较全面地反映成品与原料所含化学成分的相对关系，也能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价、全面控制，与传统中医药理论相适应。本实验建立10 批复方感冒灵颗粒HPLC 指纹图谱，发现有11 个共有峰，同时采用UPLC-Q-TOF-MS 法分析其化学成分，根据负离子模式下准分子离子峰结合裂解规律，共鉴定出17种，可为该制剂药效物质阐释及相关基础研究开展奠定基础。