刘玉薇，冯晓敏，万 楠

(北部战区总医院 检验医学中心，辽宁 沈阳110016)

近年来，心血管疾病的发生率不断上升，已成为威胁人类健康的主要疾病，尽管现在可以进行有效的再灌注以及药物治疗，但每年全球仍有1700万人死于心血管疾病[1]。MicroRNA(miRNA)在真核生物中固有的长度为21-25个核苷酸，是一类内源性非编码小分子单链RNA，特异性识别靶基因mRNA的3′非编码区，在转录后水平调控基因表达[2]。miRNAs调控生长发育并且参与许多病理生理过程，包括心血管疾病。有研究表明，在不同心血管疾病中，患者血浆miRNA含量不同，包括冠心病、心力衰竭、心肌炎、糖尿病等。重要的是，由于特定的miRNAs在心脏的各种细胞类型中差异性地富集，因此提示特定的miRNA的水平改变可能反映不同的心血管病理状态[3]。miRNA以无细胞形式存在于人体循环中，可以在外周血中检测到，并且在血浆和其他体液中发现了保护miRNA免受内源性RNA酶活性降解的稳定分子，这表明循环miRNA可能是心血管疾病中理想的生物标志物[4,5]。miR-126和miR-92a广泛存在于内皮细胞(EC)和内皮祖细胞(EPC)，被认为是生理血管生成的主要调节剂。而内皮功能障碍促进了冠脉粥样硬化的发生。因此，我们在本文中研究了血浆miR-126和miR-92a水平与冠心病的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2017年10月至2017年12月就诊于沈阳军区总医院的胸痛患者93例，其中非冠心病(non-CAD)组20例，心绞痛(AP)组24例，急性心肌梗死(AMI)组49例，所有入组患者均行冠脉造影检查。冠心病诊断参照世界卫生组织1979年《缺血性心脏病的命名和诊断标准》和中华医学会心血管病学分会2007年《不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》。排除标准：合并有急慢性感染性疾病、恶性肿瘤、肝肾功能不全、血液病、周围血管性疾病、自身免疫疾病、脑卒中、其他心脏疾病的患者及既往心肌梗死、冠状动脉支架植入术术后或冠状动脉旁路移植术术后的患者。

1.2 方法

1.2.1标本采集 在患者入院后、未进行任何干预措施前，采集肘静脉血，将EDTA-K2真空采血管中全血，4 000 r/min离心15分钟，分离血浆于无RNA酶的EP试管中，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2全球急性冠状动脉注册事件危险评分(GRACE评分) 计算年龄、心率、动脉收缩压、肌酐、ST段变化、Killip分级、心肌标志物是否升高及入院时是否心脏骤停等8项指标积分之和。

1.2.3冠脉Gensini评分 对每支冠状动脉病变狭窄程度进行定量评定，以每一冠状动脉的狭窄基本评分乘以该病变部位的系数，即为该病变血管的评分，各病变血管得分总和即为该患者冠状动脉病变狭窄程度的总评分。

1.2.4试剂与仪器 EasyPure miRNA Kit(#ER601,TransGen Biotech)试剂盒，TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(#AT311,TransGen Biotech)试剂盒，Light Cycler 480 SYBR Green IMaster(#04707516001,Roche)。罗氏480PCR扩增仪。

1.2.5miRNA检测 血浆miRNA提取及逆转录等操作步骤严格按照试剂说明书进行。所有操作步骤均在冰上完成，避免RNA的降解。以U6作为标准内参，进行实时荧光定量PCR，反应体积为20 μl,包括5 μl逆转录产物，10 μl Master Mix，正向引物1 μl，反向引物1 μl，3 μl无核酸酶水，反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环，每份样本设置3个重复孔，使用2-△Ct法分析miR-126和miR-92a的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基本资料

总共研究了93名患者，non-CAD组20人，AP组24人，AMI组49人。值得注意的是，非冠心病组并不是健康对照组，因无法对健康人群进行冠脉造影及采血，非冠心病组是通过临床表现怀疑为冠心病，但通过冠脉造影而排除的人群。AMI组较其他两组吸烟患者的百分率显著增加，高敏肌钙蛋白T(hs-cTnT)和GRACE评分明显升高，左室射血分数明显降低。Gensini积分AMI组明显高于AP组，AP组显著高于non-CAD组(表1)。

2.2 血浆中miRNA的相对表达量

如表1所示，在非冠心病、心绞痛和心肌梗死三组中患者血浆中miR-92a和miR-126水平呈递降趋势，miR-92a水平AP组较non-CAD组显著降低，差异有统计学意义(P=0.01)；AMI组较AP组有所下降，但差异无统计学意义(P=0.079)。而miR-126水平，AP组与non-CAD组相比略降低，差异无统计学意义(P=0.212)；AMI组较AP组显著降低，差异有统计学意义(P=0.013)。

2.3 miRNA与其他临床指标的相关性

进一步分析miR-92a和miR-126与其他临床特征之间的关系，发现MiR-92a和miR-126表达与hs-cTnT、Gensini评分、GRACE评分呈负相关，而与EF呈正相关(表2)。

注：a与其他两组相比，P<0.05。

表2 r值表

2.4 miRNA在冠心病中的诊断价值

绘制miR-92a，miR-126与miR-92a+miR-126对冠心病或心梗诊断的受试者工作曲线，计算曲线下面积，并以约登指数最大值处为最佳诊断界值，CHD的诊断界值为miR-92a≤18.17，miR-126≤15.71，AMI的诊断界值为miR-92a≤18.17，miR-126≤16.41，联合诊断时，任一指标低于诊断界值即诊断为阳性，各指标诊断的敏感度、特异度、准确度见表3。

表3 miR-92a和miR-126的诊断价值

3 讨论

本文结果显示，在非冠心病、心绞痛和心肌梗死三组中患者血浆中miR-92a和miR-126水平呈递降趋势，即miR-92a和miR-126水平随冠心病的严重程度的增加而降低，血浆miR-92a水平在AP和AMI患者中明显下降，而miR-126则在心梗患者中显著降低。表2表明血浆miR-92a和miR-126水平与hs-cTnT显著相关，提示其表达水平在冠心病患者中的降低可能与心肌损伤程度有关。在排除血压及其他心脏疾病的影响后，血浆miR-92a和miR-126水平与左室射血分数呈正相关，也提示miR-92a和miR-126与心脏功能的相关性可能是由于心肌损伤造成。

Rosa等人发现内皮细胞富含的miR-126的循环浓度的跨冠脉降低与心肌损伤的程度直接相关。内皮细胞富含的miR-126表现出逆冠状动脉内浓度梯度，表明肌钙蛋白阳性冠心病患者miR-126在通过冠脉循环期间被摄入或降解，并且观察到内皮细胞富集的miR-92a存在类似的模式[4]。影响血浆miRNA的水平可能包括转录、翻译、组织表达量、蛋白加工和释放等多方面因素，并且不同的miRNA有各自特异的释放和转运机制[6]。很多miRNA存在于不同的细胞外囊泡中，这些miRNA由囊泡保护而不被RNA酶降解[7,8]。另有一些miRNA可与蛋白质结合，如miR-92a与Argonaute-2蛋白结合后释放或与脂质蛋白结合后转运[9]，这些复合物可以使miRNA在一定程度上保持不被RNA酶降解。不同的保护机制导致不同的降解率：如与蛋白质结合的miRNA对可以被心梗后释放的蛋白酶水解，而囊泡内的miRNA对蛋白酶不敏感。因此，当心肌损伤时蛋白酶[10,11]或RNA水解酶[12,13]分泌增加，则可导致血浆miRNA水平降低。

表2表明患者血浆miRNA表达水平与冠脉病变程度呈明显负相关，Gensini积分越高，miR-92a和miR-126表达水平越低。目前研究认为miR-92a是内皮细胞源性血管形成抑制物[14]，在心肌缺血或肢端缺血的小鼠动物模型中其抑制血管形成作用更明显，miR-92a过表达可以减少抗粥样硬化血流调控性转录因子KLF2/4的表达，从而参与内皮损伤过程，当存在动脉粥样硬化时，心肌组织中富集miR-92a，相反，因上述转运机制的不同导致释放入血的miR-92a减少[6]。Andreas等人的研究结果表明，内皮细胞中miR-126通过抑制印记基因Dlk1维持内皮细胞的增殖储备，从而防止动脉粥样硬化病变形成[15]。也有研究表明在动脉粥样硬化层流剪切力的作用下，内皮释放的miRNA-126减少[16]。

GRACE风险评分可以准确预测冠心病患者院内临床结局和远期临床结局[17]。对于低、中、高危患者，院内死亡风险分别为<1%,1%-3%,>3%。出院后6个月死亡风险分别为<3%,3%-8%,>8%。本文研究显示血浆miR-92a和miR-126水平与GRACE风险评分呈负相关，提示血浆miR-92a和miR-126水平可能与预后相关。Karakas等人研究结果也表明miRNA水平与心肌梗死后患者的心血管预后相关，在首次前瞻性研究中发现，miR-126水平与随后发生的心梗呈负相关，并且miR-126的表达预测了一组具有症状的冠状动脉疾病患者的死亡率[18]。

本研究发现在对急性心梗进行诊断时，最佳诊断界值为miR-92a≤18.17，miR-126≤16.41，但与现有指标如hs-cTnT相比，诊断效力并不理想，二者联合诊断灵敏度为89.80%，特异度为59.09%，准确度为75.27%。虽然不稳定性心绞痛患者miR-92a的相对表达水平高于急性心梗患者，但是本研究得出的对冠心病的最佳诊断界值仍为miR-92a≤18.17，这可能是由于各组人数不均且非冠心病患者较少的原因。miR-92a与miR-126联合对冠心病诊断效力最佳，灵敏度为78.08%，特异度为80.00%，准确度为78.49%，由于miRNA检测的经济、便捷、微创等优点，或许可以作为冠心病早期发现的参考指标。此外，本研究中非冠心病组并非健康体检者，可能对结果造成影响，因此，今后需扩大样本量进一步研究。