唐宗生,汪 沁,陶雨琦,陶明芬

(皖南医学院弋矶山医院 1.输血科；2.血液净化中心，安徽 芜湖241001)

新生儿溶血症(Haemolytic disease of the newborn，HDN)是一种因母婴血型不合，母亲体内产生针对胎儿红细胞上相应抗原的IgG抗体，IgG抗体通过胎盘进入胎儿体内，从而导致胎儿发生溶血的疾病。如没有进行适当的处理，HDN可导致胎儿发生黄疸、贫血、水肿，严重的可导致胆红素脑病，甚至死亡[1]。

HDN严重影响胎儿的健康，在生产前及时检测母亲血清的抗体效价有助于评估HDN发生的可能性及危害程度[2]，临床可根据检验结果及时进行处理，减轻HDN对胎儿的危害。目前绝大多数医院对母亲血清抗体效价的检测采用的是微柱凝胶法，该方法属于半定量方法，其数值稳定性欠佳，检验结果可受诸多因素影响[3]，难以满足临床的要求。

流式细胞术是一种可快速测定细胞荧光含量的新兴方法，该方法属于定量方法，其结果客观、稳定，有利于得到准确的检验结果[4]。目前流式细胞术用于产前测定孕妇血清IgG anti-A(B)的可行性及方法学研究很少有文献报道。因此本研究以微柱凝胶法为标准，在摸索中建立了一种流式细胞术检测孕妇IgG anti-A(B)的实验方法，即利用抗人IgG荧光抗体测定结合在红细胞血型抗原上的IgG抗A(B),研究流式细胞术用于定量检测孕妇IgG anti-A(B)可行性，并比较流式细胞术与微柱凝胶法的优缺点及临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取在我院门诊产检的O型孕妇27例，年龄22-37岁，其丈夫血型为：A型(13例)、B型(10例)和AB型(4例)。用EDTA-K2抗凝管采集孕妇外周静脉血。

1.2 实验主要试剂与仪器

鼠 Anti-human IgG-FITC(美国BD公司)、流式染色Buffer(美国R&D公司)、β-巯基乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、微柱凝胶抗人球蛋白检测卡(长春博迅生物技术有限责任公司)、37℃专用孵育器及卡式离心机(长春博迅生物技术有限责任公司)、 FC500 MPL流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.3 标本检测

1.3.1实验母液制备和母液稀释 取O型孕妇血浆和β-巯基乙醇各200 μl，混匀，37℃水浴40 min，灭活IgM抗体，最终制成母液；生理盐水倍比稀释母液为： 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024。然后分别用微柱凝胶卡式法和流式细胞术检测不同浓度稀释液IgG anti-A(B)。流式细胞术需同时检测母液的IgG anti-A(B)。

1.3.2微柱凝胶抗人球蛋白试验 向微柱凝胶抗人球蛋白检测卡各微孔中加入50 μl 1%红细胞悬液和50 μl不同稀释倍数的灭活血浆。将卡置于37℃专用孵育器内孵育30 min后，离心5 min (900 rpm 2 min，1500 rpm 3 min)，取出，观察结果。以微孔中红细胞在凝胶中开始出现拖尾现象的前一管所加稀释液的倍数作为IgG anti-A(B)效价。

1.3.3流式细胞检测 设立1管同型对照管和不同稀释倍数(包括母液)的实验检测管。在流式管中加50 μl 1%红细胞悬液和50 μl灭活血浆(同型对照管以生理盐水替代血浆)，试管振荡混匀，水浴30 min；2 ml 0.9% 生理盐水洗涤细胞2次(1500 rpm 3 min)，弃上清；加500流式染色Buffer洗涤细胞1次(1500 rpm 3 min)，弃上清；每管加入鼠 Anti-human IgG-FITC 2 μl，进行染色，避光反应30 min；再用FBS洗涤2次(1500 rpm 3 min)，弃上清；每管加700 μl流式染色Buffer后上流式细胞仪检测(每份样本收集10000个细胞用作流式细胞分析。)。

1.4 结果分析

Flowjo(7.6，美国)流式软件用作分析流式细胞仪采集的数据；Graphpad prism(6.0，美国)软件用作实验结果的统计分析；非参数Spearman correlation检验用于数据的相关性分析； One-Way ANOVA用于组与组之间的差别检验；α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 研究流式细胞术与微柱凝胶卡式法检测ABO血型IgG抗体结果存在相关性

图1A流式图由前向角散射 (FSC)和侧向角散射 (SSC)构成的散点图与两个Anti-human IgG-FITC通道(流式FL1)直方图构成。在散点图所示红细胞群外周画“门”，在红细胞“门”内以Anti-human IgG-FITC通道作两个直方图：同型对照和实验对照。在两个直方图上分别画两个线性“门”，用以检测IgG anti-A(B) 总MFI 和IgG anti-A(B) 阳性百分率；孕妇IgG anti-A(B) 效价分别与母液IgG anti-A(B) 总MFI 和IgG anti-A(B) 阳性百分率成正相关(r=0.4726,P=0.0073;r=0.6158,P=0.0002)，见图1B和图1C；同时母液IgG anti-A(B) 总MFI 和IgG anti-A(B) 阳性百分率成正相关(r=0.9185,P<0.0001)，见图1D。

图1 IgG anti-A(B) 效价与母液流式结果的相关性

2.2 血型型别(A或B)对流式结果之间的相关性的影响

按血型分组，不管是A型，还是B型，单纯母液IgG anti-A(B)总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率均成正相关(r=0.9020,P<0.0001;r=0.9043,P<0.0001)，见图2A和图2B；另外，按血型分组，不管是A型，还是B型，不同稀释倍数的稀释管IgG anti-A(B) 总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率均成正相关(r=0.8913,P<0.0001;r=0.8706,P<0.0001)，见图2C和图2D。

2.3 母液IgG anti-A(B)总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率ROC曲线面积分析

以微柱凝胶卡式法结果正常参考值1∶64作Cutoff值，分别将母液IgG anti-A(B)总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率分为两组：<64组和≥64组，从而画出IgG anti-A(B)总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率ROC曲线。相比于IgG anti-A(B)总 MFI(Area=0.7405,P=0.03289)，IgG anti-A(B)阳性百分率有更大的曲线面积(Area=0.8238,P=0.0041)，见图3A。

图2 血型型别(A或B)对流式结果之间的相关性的影响

图3 母液IgG anti-A(B)总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率ROC

2.4 流式细胞术与微柱凝胶卡式法检测ABO血型IgG抗体灵敏性分析

图4A表示孕妇IgG anti-A(B)效价是1∶64时，其流式稀释管1∶64、1∶128和1∶256的IgG anti-A(B)阳性百分率的直方图；孕妇IgG anti-A(B)效价与其对应流式稀释管IgG anti-A(B)阳性百分率成反相关(r=-0.4026,P=0.0247)，见图4B；孕妇IgG anti-A(B)效价是1∶64时，其流式稀释管1∶64和1∶128的IgG anti-A(B)阳性百分率有显著差异(P=0.0044)，但稀释管1∶128和1∶256的IgG anti-A(B)阳性百分率之间无显著差异(P>0.9999)见图4C。

图4 流式细胞术与微柱凝胶卡式法检测ABO血型IgG抗体灵敏性

3 讨论

由于HDN对胎儿的危害巨大，因此给临床提供母体血清抗体效价的准确结果十分必要。目前我院对母体血清抗体效价的检测采用的是微柱凝胶法，该法与传统的试管法相比有巨大的进步，其操作简便、结果直观，尤其方便大批量标本的检验。但这种方法属于半定量，其结果不够准确、不够稳定[5,6]，与临床要求存在很大差距。

我们的结果证实微柱凝胶技术孕妇IgG anti-A(B) 效价分别与流式细胞术母液IgG anti-A(B) 总MFI 和IgG anti-A(B) 阳性百分率成正相关(r=0.4726,P=0.0073;r=0.6158,P=0.0002)，且流式母液IgG anti-A(B) 总MFI 和IgG anti-A(B) 阳性百分率有很好的相关性(r=0.9185,P<0.0001),这与杨树法[7]和Kang SJ[8]等人的结果基本相符。表明流式细胞术母液IgG anti-A(B) 总MFI 或IgG anti-A(B) 阳性百分率够均能替代微柱凝胶技术检测O型孕妇IgG anti-A(B) 效价，且无须进行倍比稀释，并获得定量结果。

在我们的研究中，流式细胞术按血型分组，不管是A型或B型，也不管是母液或稀释液管，IgG anti-A(B)总 MFI和IgG anti-A(B)阳性百分率均成正相关(r=0.9020,P<0.0001;r=0.9043,P<0.0001)(r=0.8913,P<0.0001;r=0.8706,P<0.0001)。表明流式细胞术替代微柱凝胶技术检测O型孕妇IgG anti-A(B) 效价不受血型型别(A或B型)的影响。

目前临床普遍以抗体效价是否大于1∶64来判断是否有临床意义[9,10]。因此，我们以微柱凝胶技术为标准，取正常参考值1∶64作Cutoff值，得到流式母液管IgG anti-A(B)阳性百分率受试者工作曲线(ROC)面积(Area=0.8238,P=0.0041)大于IgG anti-A(B)总 MFI的ROC面积(Area=0.7405,P=0.03289)。这个结果表明：在流式检中，同IgG anti-A(B)总 MFI相比， 用IgG anti-A(B) 阳性百分率表示孕妇IgG anti-A(B)结果，能获得更好的灵敏度和特异度。

既往研究表明1个IgG分子上有近百个赖氨酸残基[11]，至少能标记上 15～20个荧光基团[12]，一个红细胞只要结合数个IgG分子，就能通过流式细胞仪分辨出来[13]，所以流式细胞术的灵敏度远比微柱凝胶法高，我们的研究也证实了这一点。孕妇IgG anti-A(B)效价与其对应流式稀释管IgG anti-A(B)阳性百分率成反相关(r=-0.4026,P=0.0247),且孕妇IgG anti-A(B)效价是1∶64时，其流式稀释管1∶64和1∶128的IgG anti-A(B)阳性百分率有显著差异(P=0.0044)，但稀释管1∶128和1∶256的IgG anti-A(B)阳性百分率之间无显著差异(P>0.9999)。这表明，相对于微柱凝胶法，流式细胞术检测IgG anti-A(B)阳性百分率敏感性更高，但当血清被稀释到极低浓度时，流式细胞术也无法作进一步区分。

综上所述，流式细胞术与微柱凝胶技术均是检测O型孕妇IgG anti-A(B)较好的实验检测方法。我们的研究表明，流式细胞术与微柱凝胶技术两种方法检测孕妇IgG anti-A(B)的结果存在相关性，母液IgG anti-A(B) 阳性百分率能高灵敏、高特异地判断母体血清抗体效价是否大于1∶64。尽管流式细胞术检测孕妇O型孕妇IgG anti-A(B)所涉及的荧光抗体昂贵，且对仪器操作者操作技术及能力有较高要求，但相对于微柱凝胶技术，流式细胞术检测IgG anti-A(B)方法可以定量检测，且方法更简单、效率更高、敏感性更好，值得临床进一步推广。