程盼盼,王翠玲,张向晖,杨春燕*,窦翠云

(济宁医学院附属医院 1.血液科；2.检验科，山东 济宁272000)

骨髓造血微环境(包括造血干细胞、T、B、NK淋巴细胞、单核细胞)以及肿瘤免疫逃逸在多发性骨髓瘤(MM)的发病以及疾病进展中起重要作用[1,2]。 而淋巴单核细胞比在恶性肿瘤预后评估中有重要作用[3]。本研究采用流式细胞术检测57例多发性骨髓瘤患者及30例健康志愿者淋巴、单核细胞淋巴细胞亚群(T、B、NK、NKT及CD4/8双阴性、双阳性T淋巴细胞)，分析多发性骨髓瘤患者淋巴/单核细胞比、以及各淋巴细胞亚群的水平以及与β2-微球蛋白和白蛋白水平的相关性，探讨其在MM预后的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

以济宁医学院附属医院血液科2015年1月-2017年6月住院诊治的57例多发性骨髓瘤患者为研究组，所有诊断均符合张之南主编《血液病诊断及疗效标准》第3版中的国内诊断标准，其中男性33例，女性24例，中位年龄61岁(60.83±9.01，37-77岁)。依据患者免疫球蛋白进行分型，IgG型27例， IgA型25例，IgD1例，轻链4例；依据国际ISS标准分型，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例；选取30例健康志愿者为对照，其中男性20例，女性10例，中位年龄60岁(59.27±7.51，36-71岁)。

1.2 主要试剂和仪器

CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC，CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 以及溶血素为美国BD公司，流式细胞仪BD FACS Calibur，全自动生化分析仪(罗氏)，全自动血细胞分析仪(Sysmex 2100)。

1.3 实验方法

所有观察对象均于清晨空腹采取静脉血，置于EDTA-K2抗凝管，用于全血细胞分析、淋巴亚群分析及检测白蛋白和β2-MG。

1.4 淋巴亚群检测

在BD记数管中准确加入10 μl四色荧光试剂(CD3/8/45/4，CD3/16+56/45/19)和50 μl全血，充分混匀后置避光室温孵育30 min 加入2 ml 1×CD3/8/45/4，以及CD3/16+56/45/19血液，充分混匀后室温避光孵育10 min，300 g离心5 min，2 ml PBS 300 g离心5 min，加入450 μl PBS，24 h内上机检测。获取及分析采用Cellquest软件，检测时，每个样本测定管获取淋巴细胞数10000个，分析淋巴亚群。

免疫比浊法检测患者β2-MG，溴甲酚绿法检测血清白蛋白水平；全自动血细胞分析仪检测白细胞分类计数及 血红蛋白浓度，计算淋巴单核细胞比值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 21.0软件包进行统计分析，两组间比较采用独立样本T检验， 各参数相关性采用Spearman相关性检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各指标与正常对照相比

与正常对照相比(见表1)，MM病例组LMR减低，而淋巴细胞亚群中总T，Ts细胞较正常对照增高，其中CD4/8双阳性及双阴性T淋巴细胞均较正常对照组增高，且差异具有统计学意义，B淋巴细胞较正常减低，虽然NK细胞MM组较正常组增高，但差异无统计学意义。

2.2 相关性研究

分析淋巴单核比及各淋巴亚群与白蛋白、β2-MG的相关性，发现T淋巴细胞亚群及Ts与白蛋白呈正相关(R=0.293，P=0.027；R=0.257，P=0.005)，CD4/8双阴性T淋巴细胞与β2-MG正相关(R=0.442，P=0.001)，NK细胞与白蛋白呈负相关(R=-0.280，P=0.035)。见图1-4。

表1 MM组 与正常对照组淋巴单核比以及淋巴亚群检测值

3 讨论

淋巴细胞和单核细胞均为机体的免疫细胞，他们通过局部免疫抑制和抑制血管生成改变了肿瘤微环境，低淋巴细胞计数被证实与不同类型癌症患者的总生存期呈负相关，而高单核细胞计数是恶性肿瘤患者预后差的因素之一。淋巴/单核比(LMR)作为肿瘤患者常规进行的、经济便利的检测指标，可以早期对患者的预后做出一定程度的评估[3]。 在MM病例中，LMR可作为无进展期生存(PFS)以及总生存期的(OS)检测指标，Alessandra Romano等人观察并随访了208例MM患者，将3.6作为LMR的最佳临界值，发现初诊LMR低于3.6的患者其无进展期生存要低于LMR大于3.6的患者[4]。我们结果提示MM患者LMR比健康对照要低，但没有发现与白蛋白、微球蛋白相关，提示LMR与MM疾病的发病有关，但与其他指标的相关还有待于进一步研究。

图1CD4/8双阴性T淋巴细 图2T淋巴细胞与白蛋白 图3Ts淋巴细胞与白蛋白图4NK淋巴细胞与白蛋胞与β2-微球蛋白相关性相关性相关性白相关性

B细胞通过中和作用、调理作用、激活补体的方式介导机体体液免疫应答。此外，B淋巴细胞可加工提呈可溶性抗原给T淋巴细胞，活化的B细胞还可以分泌各种细胞因子调节机体免疫功能。本研究结果显示，MM 患者体内CD19细胞的表达明显低于正常对照组。说明MM患者机体存在体液免疫功能的低下和免疫调节功能的异常。B细胞相关抗原作为CART的靶点在MM治疗中有效提示B淋巴细胞与MM的疾病进展相关[5]。有研究证实骨髓中单个核细胞中B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(Blimp1)的表达与多发性骨髓瘤预后呈负相关[6]，提示B淋巴细胞在MM的疾病进展中有作用。但在与白蛋白以及微球蛋白相关性研究中没有发现相关性，与其他指标的相关性还有待于进一步研究。

研究发现，MM伴有T淋巴细胞的表型和功能异常[7]，高鹏等人在对MM的研究中发现，NK、调节T淋巴细胞以及CD8+T淋巴细胞的比例增高，B淋巴细胞、CD4/CD8比值降低[8]。在我们的研究结果中，除CD8+细胞增高，B淋巴细胞和CD4/CD8比值减低外，T淋巴细胞中CD4/8双阳性及双阴性T淋巴细胞比例也增高。CD4/8双阳性T淋巴细胞虽然比例低，对其研究也少见，但是在抗病毒免疫中发挥作用，研究指出CD4/8双阳性细胞含有记忆淋巴细胞对潜在高水平病毒感染抗原的特异效应器[9]，而CD4/8双阴性细胞通过穿孔素以及细胞-细胞间的作用抑制B淋巴细胞的增殖从而免疫球蛋白和抑制免疫反应。我们的研究结果T淋巴细胞与Ts细胞与白蛋白呈正相关，提示T淋巴细胞以及Ts细胞的增高与MM的预后相关。CD4/8双阳性以及双阴性T淋巴细胞在MM中的作用以及对其免疫功能的影响也将是我们进一步研究的内容。

我们的研究结果中，NK淋巴细胞比例增高，差异无统计学意义，但是，MM中NK淋巴细胞活性减低，研究证实，骨髓瘤细胞来源外泌体在对NK 细胞功能的抑制中起到了重要作用[10]。而我们的研究中发现NK细胞与白蛋白呈负相关，也间接证实了NK淋巴细胞与MM的疾病进展相关。

综上所述，LMR以及淋巴亚群在MM中的异常水平提示MM的免疫功能紊乱，而淋巴亚群与MM分期相关的白蛋白、β2-微球蛋白相关，提示淋巴亚群的变化与MM的预后相关。