周雨薇,吕 阳*,陈 茜,王海峰,陈 滨,刘 涛,何 欣,张 雷

中国严寒地区细颗粒物细菌群落特征研究

周雨薇1,吕 阳1*,陈 茜1,王海峰1,陈 滨1,刘 涛2,何 欣2,张 雷3

(1.大连理工大学土木学院,辽宁 大连 116024；2.大连理工大学环境学院,辽宁 大连 116024；3.东北石油大学地球科学学院,黑龙江 大庆 163318)

通过对中国严寒地区典型城市大庆市供暖季3类建筑(办公室、教室、住宅)室内外共计110个测点长期监测,分析大庆市供暖季室内外细颗粒物关联性,并基于16S rDNA基因测序技术和BLAST源解析技术研究大庆市供暖季3类建筑室内外细颗粒物上细菌的组分及来源.研究结果表明:大庆市供暖季室内外PM2.5平均质量浓度分别为(32±22)和(45±34)μg/m3.其中办公室的平均渗透系数处于较低的状态(0.2886),教室的渗透系数处于较高的状态(0.5702),农村住宅(0.6513)比城市住宅的渗透系数略大(0.6057).不同类型建筑室内细颗粒物中的细菌组分存在一定差异,室外细颗粒物中的细菌组分根据采样地点也存在不同,但整体上厚壁菌门()、变形菌门()、拟杆菌门()和生氧光细菌()是大庆市供暖季细颗粒物中的优势菌群. 3类建筑室内外细颗粒物细菌来源主要为土壤、水体、人体、腐败有机物和粪便,但不同建筑类型及采样区域的细菌来源比例具有一定差异性.室内较室外人体来源所占比重大,而室外较室内土壤来源比重大.

中国严寒地区；大庆市；细颗粒物；细菌；来源

近年来,东北地区作为中国老工业基地,雾霾天气和区域空气重度污染事件频发.室内外空气中的颗粒物通过人体的呼吸作用进入呼吸道,特别是细颗粒物(PM2.5),由于粒径小且表面积大,吸附能力更强,富含更多的致病性物质,能突破口鼻,深入呼吸系统内部,甚至渗透进入血液[1].越来越多的流行病学表明人体发病率以及死亡率与细颗粒物的质量浓度存在正相关性[2].虽然人类生命的绝大多数时间是在室内环境中度过的,但室外环境中的污染物可通过多种途径进入到室内,如自然通风、机械通风和渗风等,这就导致室内外环境中的颗粒物浓度存在着显著的关联性,有研究显示室内环境中来源于室外环境的PM2.5占30%~75%[3-6].颗粒物的表面不仅富集了重金属、有机物、无机物,并且还是细菌、真菌和病毒等微生物存活的载体[7].微生物气溶胶不但会引发SARS、H1N1流感等大规模传播,而且它所导致的下呼吸道感染是人类健康的第三大杀手. 同时室外颗粒物污染对不同性别人群会产生不同的健康效应[8].细颗粒物上细菌的含量占据细颗粒物上微生物总含量的86.1%[9].且不同来源的微生物种类、排放浓度以及毒性都不同[10].2014年朱听等人[11]利用宏基因组学分析技术鉴别大气悬浮颗粒物中的微生物成分,发现其中大部分为非致病性微生物,并且很多来自于土壤,但也含有极少量可能致病或致过敏微生物的DNA序列.2015年王步英等人[12]利用16s RNA基因测序与宏基因组对比北京雾霾天分析发现,尽管采样时间和采样地点有较大差异,大气中普遍会存在一些相同的细菌种类,而PM2.5和PM10中细菌群落结构特征呈现出相似的规律. 2016年苟欢歌等人[13]利用16s rDNA基因测序技术研究了乌鲁木齐市冬季PM10和PM1污染物中细菌的群落结构与其潜在的来源环境.并表明室外空气微生物的主要来源为土壤,动物排泄物和淡水等. 2013年,Bertolini等人[14]对意大利北部城市空气中细菌群落结构进行了分析,发现空气微生物主要由放线菌目、鞘菌目和少量变形菌目构成,且空气细菌菌落的时空变化与环境因素有关. 受地理位置、气候分布和建筑类型等因素的影响,中国东北地区不同建筑室内外环境中细颗粒物的关联性与其他地区相比存在较大不同,并且目前关于细颗粒物组分来源的研究主要集中在化学污染方面,而对细颗粒物中微生物污染研究相对较少[15-17].

本研究通过对中国严寒地区典型城市大庆市进行长达4个月(2016年11月至2017年3月)的供暖季监测,分析3类建筑(办公室、教室、住宅)共计110个测点,讨论大庆市供暖季3类建筑室内外细颗粒物的关联性,并利用16S rDNA基因测序技术和BLAST源解析技术对附着在细颗粒物上的细菌群落进行组分及来源研究.

1 材料与方法

1.1 实测对象和采样点选取

考虑到人群活动集中程度、人群的年龄差异、停留时间以及不同功能的建筑差异等因素,本文选择3类建筑类型作为实测对象,即:办公室、教室和住宅(分为城市住宅和农村住宅).由于每种建筑类型实测结果具有一定的差异性,为了获得具有代表性的数据和统计学意义的样本量数据,本研究样本量的计算主要根据样本量统计学公式:

式中:＝0.05,对应的为1.96;为相对误差,为保证数据的精度,取0.2; CV为变异系数,主要参考前人开展室内颗粒物监测结果的变异性来确定,如根据赖森潮等人[18]对广州市部分居室空气中PM2.5污染特征检测的结果,居民室内的PM2.524h平均浓度为47.4µg/m3,标准差为17.7µg/m3.则公式中CV＝17.7/47.4＝0.37.可求得实测样本量N＝13,但考虑到还需要对样本数据进行概率统计分析,本研究初步确定研究区域办公建筑、教学楼每种类型监测样本数量不少于30个,住宅监测样本量不少于50个.

本实测点覆盖大庆市5个区(大同区、萨尔图区、龙凤区、让胡区及红岗区),共计选取110个采样点.其中教室样本30个,办公室样本30个,住宅样本50个(其中城市住宅样本为38个,农村住宅样本12个).采样点分布范围如图1所示(红框内区域为采样范围,星号表示每个区的气象监测站位置).研究于2016年11月1日至2017年3月31日,即大庆市供暖季进行了集中采样.所选取的3类典型建筑均在20世纪90年代建成,建筑墙体为砖墙,外墙平滑无裂纹,窗户均为双玻塑钢窗,其中城市住宅阳台外墙均装有保温苯板.供暖方式为热力站集中供热,室内供暖系统均采用上供下回垂直单管系统,室内散热器为圆形翅片结构.大庆市供暖季室外采样温度为(-29±3)℃,相对湿度维持在50%至60%;室内采样温度为(26±1)℃,相对湿度维持在40%至70%.

图1 大庆市各区域采样情况分布

1.2 数据的采集及测点方案

1.2.1 数据的采集 室内外颗粒物浓度的收集采用QT50颗粒物检测仪,内置有数据存储模块和WIFI模块,在联网情况下可将实时数据上传至云端服务器.测量内容主要包括:温度、相对湿度、PM2.5的质量和数量浓度,其中PM2.5的质量浓度测量范围为0至900μg/m3,仪器分辨率为1μg/m3,测量误差(单机波动性)£±10%.本研究将在线监测仪的检测间隔设定为15min,每次设备启动均采集5min的数据.颗粒物检测仪在使用前进行了多机平行比对,即在相同的室内环境中将QT50与TSI8530进行了20h以上的同步检测,根据TSI8530测量的结果对QT50空气颗粒物检测仪的测量结果进行修正,如图2所示.

室外气象参数的收集采用当地气象站发布的实时数据,包括室外温湿度、大气压、风速风向等参数.大庆市共有5个气象监测站,分别分布于大同区、萨尔图区、龙凤区、让胡路区及红岗区,根据实测地点就近选择对应的气象站数据.

1.2.2 测点的布置 采样点布置按照国家标准《室内空气质量标准》(GB/T18883-2002)规定,室内外各布置一个测点,室外点尽量布设在与室外环境直接接触的窗台处,实验设备及仪器还应避免阳光直射.室内点统一布设在住宅客厅位置,离墙0.5m以上,高于地面0.5m.

1.3 样品采集及细菌测序数据处理

首先利用膜采样法对室内外的颗粒物进行采样,采样仪器为室内外各一台Omni5000IS大流量空气采样器加装PM2.5切割头,流量取1.13m³/min,采样时间为24h,并记录了滤膜采样前后的重量变化;所采用的滤膜为特氟龙滤膜(直径37mm;孔径2.0μm, Whattman, England),在使用前放在500℃马弗炉进行灼烧5h.同时对托盘镊子和切割头等实验用具均进行了75%酒精消毒以防微生物污染对实验结果的干扰.选取不连续的室内外办公室样本6个,教室样本6个,住宅样本12个(其中城市和农村住宅样本各6个).在进行测序之前,采集样品后的滤膜放置于-80℃冰箱保存.本研究采用CTAB法对样本基因组DNA进行提取,之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度,取适量样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至1ng/μL.以稀释后的基因组 DNA 为模板,根据测序区域的选择,使用带Barcode的特异引物,New England Biolabs公司的Phusion® High- Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增;对样本细菌的16S V4区引物(515F和806R)进行扩增,PCR产物则使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测;根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物,剪切回收目标条带.使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48rxns建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后,使用Thermofisher的Life Ion S5TM或Ion S5TMXL进行上机测序;使用Cutadapt(V1.9.1)[19]先对reads进行低质量部分剪切,再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据,截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据,经以上处理后得到的Reads需要去除嵌合体序列,Reads序列通过UCHIME Algorithm[20]与数据库Gold database进行比对检测嵌合体序列,并最终去除其中的嵌合体序列[21],得到最终的有效数据;利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)[22]对所有样品的全部有效数据进行聚类,默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs,同时会选取其中出现频数最高的作为代表序列.对OTUs代表序列进行物种注释,用Mothur方法与SILVA[23]的SSUrRNA数据库[24]进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1),获得分类学信息.使用MUSCLE[25](Version 3.8.31)软件进行快速多序列比对,得到所有OTUs代表序列的系统发生关系;最后对各样品的数据进行均一化处理.

2 结果与讨论

2.1 室内外细颗粒物浓度关联性分析

本文采用细颗粒物平均质量浓度和平均渗透系数2个指标来表示供暖季室内外细颗粒物浓度关联性.其中渗透系数(inf)表征了平衡状态下室外环境中颗粒物进入并且悬浮在室内空气中的比例,公式如下所示[26]:

式中:in为室内颗粒物浓度,μg/m3;out为室外颗粒物浓度,μg/m3;s为室内颗粒源浓度,μg/m3.

通过对室内外环境中颗粒物浓度的线性回归即可计算出室内外颗粒物之间的平均渗透系数,即:

2.1.1 办公建筑 图3为30间办公室供暖季室内外细颗粒物浓度及渗透系数计算结果,供暖季办公室各测点室内外PM2.5的平均质量浓度分别为(44±33)和(75±65)μg/m3,办公室PM2.5的平均渗透系数为0.2886.

2.1.2 教学楼 图4为30间教室供暖季室内外细颗粒物浓度及渗透系数计算结果,供暖季教室各测点室内外PM2.5平均质量浓度分别为(23±13)和(30±19)μg/m3,教室PM2.5的平均渗透系数为0.5702.

2.1.3 住宅建筑 图5为50间教室供暖季室内外细颗粒物浓度及渗透系数计算结果,其中DQH001~ DQH038为城市住宅,DQH039~DQH050为农村住宅.供暖季城市住宅各测点室内外PM2.5平均质量浓度分别为(28±20)和(35±25)μg/m3,城市住宅PM2.5的平均渗透系数为0.6057;对于农村住宅,供暖季各测点室内外PM2.5平均质量浓度分别为(33±27)和(39±33)μg/m3,农村住宅PM2.5的平均渗透系数为0.6513.

综上,大庆市供暖季室内外PM2.5质量浓度的平均水平分别为(32±22)和(45±34)μg/m3.其中办公室的平均渗透系数处于较低的状态(0.2886),教室的渗透系数处于较高的状态(0.5702),这主要是由于办公室的建筑气密性以及室内人员的活动特点决定的,办公室气密性较好且人员开关门窗的频率较低,而对于教室,建筑结构的气密性较差以及人员的频繁活动造成了室外更多的细颗粒物被带入室内,引起室内渗透系数的升高.农村住宅(0.6513)比城市住宅的渗透系数略大(0.6057),这主要与农村住宅和城市住宅封闭的门窗等围护结构的气密性有关.

将严寒地区典型代表工业城市大庆市(46°N, 125°E)与北纬45°~55°的城市进行对比,美国供暖季西雅图市(47°N,122°W)122户公寓室内外平均渗透系数为0.59[27],加拿大乔治王子城(53°N,122°W)21户别墅室内外平均渗透系数为0.27[28],由此可见中国东北地区住宅建筑室内外颗粒物的渗透系数较同纬度带城市偏高.

2.2 室内外细颗粒物细菌群落组分特征分析

对大庆市供暖季3类建筑类型室内外细颗粒物细菌群落的前10名共有门类进行分析,如图6所示.研究结果发现,办公室室内细颗粒物细菌群落主要由变形菌门()(25.9%)、厚壁菌门()(22.9%)和生氧光细菌() (14.9%)组成,室外为变形菌门() (29.3%)、厚壁菌门()(22.8%)和拟杆菌门()(15.9%).变形菌门()和厚壁菌门()为办公室室内外共有优势细菌门类,并且2种菌门所占比例近似相等,但不同于室外[拟杆菌门()15.9%>生氧光细菌()7.3%],办公室室内生氧光细菌()所占比重高于拟杆菌门()(14.9%>10.8%),可能原因为大庆市办公建筑气密性较好,供暖季开关门窗的频率较低,人员密度大,而人体本身就是移动的湿源,加之供暖季建筑内无主动排风设备,导致室内水蒸气大量凝结积累,引起办公室室内来自于水体的生氧光细菌()大量繁殖,使拟杆菌门()占比相对降低,引起室内外生氧光细菌()(室内:14.9%;室外:7.3%)和拟杆菌门()(室内:10.8%;室外:15.9%)比重变化.教室室内细颗粒物细菌群落主要由拟杆菌门()(35.8%)、厚壁菌门()(28.5%)和变形菌门()(19.5%)组成,室外为变形菌门()(30.6%)、拟杆菌门()(24.3%)和厚壁菌门() (19.1%),由于教室室内外细颗粒物具有较高的渗透系数导致三大优势细菌门类均相同,但三者的相对丰度百分比却存在较大差异,主要是由于拟杆菌门()和厚壁菌门()大部分来源于人体及动物,教室室内人员密度远大于室外导致细菌相对丰度存在较大差异.城市住宅室内细颗粒物细菌群落主要由厚壁菌门()(43.5%)、变形菌门()(37.2%)和放线菌门()(7.4%)组成,室外为变形菌门()(29.7%)、厚壁菌门() (17.6%)和生氧光细菌()(12.2%),由分析结果可知,变形菌门()和厚壁菌门()为城市住宅室内细菌的优势门类,占比超过80%,室外细颗粒物优势细菌门类较多且占比相较均匀,可能原因为城市住宅供暖季室内环境构成单一,包括稳定的室内温湿度以及以人为主体的细菌散发源,而城市住宅室外环境构成因素较多,包括树木、喷泉、土壤以及移动的汽车等,这些都是影响细菌优势门类比重的重要影响因素;农村住宅室内细颗粒物细菌群落主要由生氧光细菌()(30.6%)、厚壁菌门() (14.6%)和变形菌门()(13.1%)组成,室外细颗粒物细菌优势菌门为厚壁菌门() (33.9%)、变形菌()(24.5%)和拟杆菌门()(24.0%),农村住宅室内外优势细菌门类比重特征与城市住宅类似,但相较于城市住宅室内地面多由瓷砖或复合型木制地板组成,沉积大量土壤和腐败有机物的农村住宅地面具有更强的蓄水能力,加之农村住宅人员特有的生活方式,如在室内长期存放生活用水和多使用灶进行烹饪而不具有良好的排风系统,导致室内水蒸气大量凝结积累,从而引起来自于水源的生氧光细菌()大量繁殖.

综上,将严寒地区典型城市大庆市实测结果与中国其他气候分区典型城市进行对比,如图7所示.寒冷地区典型代表城市西安市冬季教学楼室外PM2.5的优势细菌门类为变形菌门() (73.70%)和厚壁菌门()(19.15%),两者比重远大于大庆市(92.85%>49.7%),并且拟杆菌门()比大庆市比重小(1.43%>24.3%)[29];夏热冬冷地区典型代表城市杭州市冬季教学区室外空气中的优势细菌门类为变形菌门() (35.83%)、放线菌门()(14.92%)和蓝藻细菌()(12.72%),与杭州市相比,大庆市教室室外细颗粒物中变形菌门() (30.6%)、拟杆菌门()(24.3%)和厚壁菌门()(19.1%)所占比重较大[30];温和地区典型城市昆明市冬季商住混合区室外细颗粒物的优势细菌纲类为放线菌纲(,属放线菌门)(>50%)甲型变形菌(Alphaproteobacteria,属变形菌门)和异常球菌纲(Deinococci,属栖热菌门),细菌优势门类与大庆市相比差异较大,但都是变形菌门()比重最大[31];夏热冬暖地区典型城市厦门市冬季室外教学楼大气细颗粒物中厚壁菌门()、变形菌门()占比达85%,细菌优势门类与大庆市类似,但大庆市冬季室外教学楼大气细颗粒物中细菌群落门类占比相对均匀[32].

图6 3类建筑室内外PM2.5样本中丰度前10的细菌门类占比

2.3 室内外细颗粒物细菌群落来源特征研究

根据BLAST源解析技术,对大庆市供暖季3类建筑室内外细颗粒物细菌的已知近源序列进行来源预测,如表1所示.供暖季办公室内外细颗粒物细菌来源比重相似;供暖季教室室内的人体来源和粪便来源比重要远高于室外,主要是由于室内人员密度较大导致的.而教室室外土壤来源比重要大于室内,原因是实测教室室外地面多为沙土,各类活动引起的扬尘导致室外来源于土壤的细菌所占比重较大;由于城市住宅供暖季室内环境构成单一,包括稳定的室内温湿度以及以人为主体的细菌散发源,人体和粪便来源所占比例超过了85%,其中人体来源占比近半;而城市住宅室外环境构成因素较多,包括树木、喷泉、土壤以及移动的汽车等,导致细菌来源类型较多且比重相对均匀;区别于城市住宅周围大量的建筑与汽车,农村住宅室外环境构成多为土壤,树木和牲畜,导致了农村的土壤来源比重较大;并且农村住宅室外细菌中粪便来源比重要高于室内,这也符合了上述的客观条件.

图7 不同气候区典型城市分布

表1 不同建筑类型室内外细菌来源预测(%)

3 结论

3.1 实测期间严寒地区大庆市供暖季室内外PM2.5质量浓度的平均水平分别为(32±22)和(45±34)μg/m3.其中办公室的平均渗透系数相对较低(0.2886),教室的渗透系数相对较高(0.5702),农村住宅(0.6513)比城市住宅的渗透系数略大(0.6057).这主要与不同建筑类型具有不同的建筑气密性及室内人员活动方式有关.

3.2 不同类型建筑室内细颗粒物中的细菌组分存在一定差异,室外细颗粒物中的细菌组分根据采样地点也存在不同.但整体上厚壁菌门()、变形菌门()、拟杆菌门()和生氧光细菌()是大庆市供暖季细颗粒物中的优势细菌菌群.

3.3 三类建筑供暖季室内外细颗粒物细菌来源主要为土壤、水体、人体、腐败有机物和粪便.但不同建筑类型及采样区域的细菌来源比例具有一定差异性. 整体上室内较室外人体来源所占比重更大,室外较室内土壤来源所占比重更大.

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Characteristics ofbacterial communities infine particulate matter of severe cold region, China.

ZHOU Yu-wei1, LV Yang1*,CHEN Xi1, WANG Hai-feng1, CHEN Bin1, LIU Tao2, HE Xin2, ZHANG Lei3

(1.School of Civil Engineering,Dalian University of Technology, Dalian 116024, China；2.School of Environment, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China；3.School of Geoscience, Northeast Petroleum University, Daqing 163318, China)., 2019,39(9)：3616~3623

Through the long-term monitoring of indoor and outdoor fine particles of 3building types (office, classroom and residence) for 110 samples in heating season of Daqing, a typical city in cold region of China, it analyzed the relationship between indoor and outdoor fine particles during heating season. Using 16S rDNA gene analysis method and BLAST source apportionment, the components and sources of bacterial communities in fine particles of 3building types indoors and outdoors were studied. The results showed that average mass concentrations of indoor and outdoor PM2.5in Daqing were (32±22) and (45±34)μg/m3, respectively during heating season. The average permeability coefficient of office was lower (0.2886), classroom was higher (0.5702), and rural residence (0.6513) was larger than urban residence (0.6057) slightly. Firmicuts, Proteobacteria, Bacteroidetes and Oxyphotobacteria were the dominant bacterial phyla in fine particulate matter of Daqing during heating season on the whole. The sources for 3building types of bacteria in fine particulate matter indoors and outdoors were mainly soil, water, human, corrupt organic and faeces, while different building types and sampling sites led to different source proportions of bacteria.

severe cold region of China；Daqing；fine particulate matter；bacteria；source andcomponents

X513

A

1000-6923(2019)09-3616-08

周雨薇(1994-),女,黑龙江牡丹江人,硕士研究生,主要从事室内外空气品质研究工作.

2019-02-11

国家自然科学基金资助项目(91743102,51578103,51308088);国家环保公益专项(201509063);中央高校基本科研业务费资助项目(DUT18JC21)

* 责任作者, 副教授, lvyang@dlut.edu.cn