王一霖， 滕 亮， 王中志， 王 妍， 林文婷， 陈江汉

新生隐球菌是一种环境致病菌，可以感染人类和许多哺乳动物的肺、皮肤、骨骼等全身各器官，但以侵犯中枢神经系统最常见（即为隐球菌性脑膜炎）。据估计，仅2014年就新增223 100例隐球菌性脑膜炎病例，其中73%发生在非洲[1]。与欧美、非洲等地区隐球菌性脑膜炎主要发生在AIDS人群不同，我国主要发生在非AIDS的无免疫功能缺陷的人群，但在治疗上却比免疫功能受损的患者疗程更长，治疗更困难[2]。隐球菌性脑膜炎患者如不及时治疗，86%在1年内死亡，即使现代医疗的情况下，病死率仍有20%～30%[3]。因此，如何有效防治新生隐球菌中枢神经系统感染，是目前亟需解决的问题。

微小RNA（miRNA）是一类长度约为20～24个核苷酸非编码小RNA分子，主要在转录后水平调节靶基因表达，参与细胞分化、信号转导、免疫应答、肿瘤发生等多种生命活动。miR-155-5p参与免疫细胞的发育分化，在活化的巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞中表达明显增加，并在免疫应答中发挥重要作用[4-5]。核因子κB抑制蛋白E（IKBKE）是IκB激酶家族（IKKs）新近发现的成员，可通过调节核转录因子-κB（NF-κB）信号转导途径，在固有免疫系统中发挥重要作用[6]。通过前期mirnada网站预测，发现miR-155-5p和IKBKE基因有结合位点，而miR-155-5p和IKBKE基因均参与细胞炎性反应，因此猜测miR-155-5p通过靶向降解IKBKE信使RNA（mRNA）在人单核巨噬细胞（THP-1细胞）抗新生隐球菌免疫反应中发挥着作 用。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞购于中国科学院细胞库；新生隐球菌标准株WM148来自上海长征医院皮肤科真菌储藏室；胎牛血清购自Gibco公司，细胞培养基RPMI-1640、Opti-MEM培养基及磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Hyclone；肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-6 Elisa试剂盒来自中国欣博盛生物科技公司；异丙醇、三氯甲烷和无水乙醇来自鼎国生物技术有限公司；miR-155-5p mimics、IBKEK siRNA购自中国锐博生物公司；miR-155-5p、U6引物购自上海生工生物工程公司；反转录试剂盒和Trizol购自TaKaRa公司；实时荧光PCR试剂盒购自ABM公司；Dual-Luciferase®Reporter Assay System购自Promega公司；X-tremegene HP购自罗氏公司；佛波酯（PMA）购自SIGMA公司；脂质体2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞、菌株培养 THP-1细胞培养于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中；2～3 d换液1次，细胞密度达80%时传代培养。WM-148标准株培养于YEPD培养基（2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母提取物）中，30 ℃培养，收集菌株予0.9% NaCl溶液冲洗2遍后65 ℃条件下灭活1 h，计数并调整菌液浓度。

1.2.2 细胞分组、干预及收集样品 将浓度为1×106/mL的THP-1细胞液2 mL接种于6孔板，每孔加入200 ng PMA，48 h诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞，按照菌与细胞5∶1数量比加入已灭活的新生隐球菌进行干预，在0 h、3 h、6 h、9 h和12 h时间点离心收集细胞及上清液，保存于-80 ℃冰 箱。

1.2.3 反转录合成cDNA及qPCR检测 Trizol法提取总RNA后，利用紫外分光光度计将RNA浓度调整至500 ng/μL左右，miR-155-5p反转录10 μL体系（mRQ缓冲液5 μL、mRQ酶混合物1.25 μL及RNA样品3.75 μL），反应条件为37 ℃ 1 h、85 ℃5 min；IKBKE反转录10 μL体系（5×PrimeScript RT预混合溶液2 μL、RNA样品500 ng、无酶水加至10 μL），反应条件为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s；miR-155-5p及U6实时荧光PCR 25 μL体系[无酶水9.5 μL、SYBR 12.5 μL、MRQ 3'引物0.5 μL（U6上游引物）、miRNA引物0.5 μL（U6下游引物）、cDNA 2 μL]，反应步骤为：①95 ℃ 5 min，②95 ℃ 10 s，③63 ℃ 15 s，④72 ℃ 5 s（步骤②～④重复40个循环），进行溶解曲线分析，采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。引物见表1。

1.2.4 检测上清液TNF-α和IL-6含量 利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，按照试剂盒操作步骤进行操作，于分光光度计450 nm处检测各组吸光值。根据标准品线性回归方程计算各组细胞因子的浓度。

表1 qRT-PCR引物信息表Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR in this study

1.2.5 验证miR-155-5p与IKBKE基因的靶向关系 将实验分为6组，分别是海肾荧光素酶（pRL）质粒+模拟物（mimics）阴性对照（NC）、pRL质粒+miR-155-5p、pRL质粒+IKBKE 3'UTR+mimicsNC、pRL质粒+IKBKE 3'UTR+ miR-155-5p、pRL质粒+IKBKE 3'UTR-突变型（mut）+mimicsNC、pRL质粒+IKBKE 3'UTR-mut+miR-155-5p。将生长良好的细胞分入24孔培养板培养，按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染24 h后荧光显微镜下观察细胞内荧光标记基因的表达情况，然后使用“Dual-Luciferase®Reporter Assay System（E1910，promega）”试剂盒处理细胞、进行荧光素酶表达检测。

1.2.6 IKBKE siRNA的转染 将实验分为空白对照组和转染IKBKE siRNA组，用不含抗生素和血清的培养基稀释IKBKE siRNA后，将其加入生长良好的细胞中，转染6 h后测定IKBKE、TNF-α和IL-6的表达变化。

1.2.7 miR-155-5p mimics的转染 更换细胞液，调整好细胞生长的状态；将实验分为4组，分别是0 h对照组、6 h对照组、0 h mimics组、6 h mimics组，用脂质体2000试剂盒，按照试剂盒操作步骤进行操作，实验组转染miR-155- 5p mimics，对照组转染miR-155-5p mimics对照物，检测转染效率，提取RNA和上清液进行下一步实 验。

1.2.8 统计学方法 根据SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差表示，两组样本均数的比较采用t检验，各组间的两两差异比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-155-5p、IKBKE、TNF-α和IL-6在新生隐球菌诱导THP-1细胞后的表达变化

新生隐球菌诱导THP-1细胞后，以0 h为对照，miR-155-5p在3 h、6 h、9 h、12 h表达量均升高，其中在6 h升高最为显著（P＜0.01），随后逐渐下降；IKBKE在3 h、6 h、9 h下降量与0 h比较差异有统计学意义，其中在6 h下降最显著（P＜0.01），TNF-α和IL-6表达逐渐增加，其中TNF-α在9 h达到峰值。见图1。

2.2 双荧光素酶报告系统验证miR-155--55pp和IKBKE 3'非翻译区（3' UTR）区域的相互作用

根据mirnada网站预测结果，miR-155-5p和IKBKE基因有结合位点（图2A）。双荧光素酶报告系统进一步验证了这一点：miR-155-5p作用后IKBKE 3'UTR活性下降了30%，说明miR-155-5p能够作用IKBKE 3'UTR区域，引起IKBKE 3'UTR活性下降；将IKBKE 3'UTR进行突变后，IKBKE 3'UTR-mut活性较野生型增加15%，而与对照组相比差异无统计学意义（图2B），说明突变位点对miR-155-5p的结合很重要，可能是其相互结合的位点。见图2。

2.3 miR-155-5p通过调控IKBKE进一步调节THP-1细胞的功能

经转染miR-155-5p mimics，miR-155-5p实验组较对照组在6 h表达明显增加，证明转染效率较高，相对应IKBKE基因6 h实验组较6 h对照组表达下降，进一步验证了miR-155-5p与IKBKE的靶向关系；检测上清液因子发现实验组 TNF-α和IL-6在6 h表达均较对照组增加，表明miR-155-5p表达增加促进了THP-1细胞中TNF-α和IL-6的表达。见图 3。

图1 新生隐球菌诱导后miR-155-5p和IKBKE的表达倍数变化以及TNF-α和IL-6的表达量变化Figure 1 Fold change of miR-155-5p expression and IKBK expression，TNF-α expression and IL-6 expression at different time points after induction by C. neoformans

图2 miR-155-5p和IKBKE基因的结合位点（A）及双荧光素酶报告系统中IKBKE 3'UTR和IKBKE 3'UTR-mut的活性变化（B）Figure 2 Binding site of miR-155-5p and IKBKE（Panel A）， activity change of IKBKE 3'UTR and IKBKE 3'UTR-mut in the dual luciferase reporter system（Panel B）

2.4 IKBKE siRNA转染THP-1细胞后TNF-α和ILL--66的表达变化

经转染IKBKE siRNA，IKBKE含量在6 h下降，表明转染效率较高，而TNF-α和IL-6在6 h表达增加，表明经抑制IKBKE能够促进TNF-α和IL-6的表达。见图4。

3 讨论

发生在我国免疫正常人群的隐球菌性脑膜炎病原菌多为新生隐球菌，该病病情凶险，病死率高，疗程长，治疗费用高，对患者和社会都是沉重的负担，迫切需要对其发病机制及治疗手段进行研究[2]。

THP-1细胞是人体固有免疫系统的重要组成部分，在外界因素刺激下可被激活为经典激活巨噬细胞（M1型）和替代激活巨噬细胞（M2型）：M1型细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，具有很强的杀菌作用；M2型巨噬细胞分泌转化生长因（TGF）-β、精氨酸酶1（Arg1）、IL-10等炎性因子，可抑制炎性反应[7]。在新生隐球菌性脑膜炎患者中，M1型细胞有助于清除病原体，而M2型细胞介导免疫逃逸[8]，因此促进THP-1细胞向M1型极化有助于治疗隐球菌性脑膜 炎。

图3 转染miR-155-5p mimics及其对照物后，miR-155-5p和IKBKE的表达倍数变化及TNF-α和IL-6的表达量变化Figure 3 After transfection of miR-155-5p mimics and its controls， the fold change of expression of miR-155-5p and IKBKE and the changes of expression levels of TNF-α and IL-6

图4 转染IKBKE siRNA及其对照物后IKBKE的表达倍数变化及TNF-α和IL-6的表达量变化Figure 4 After transfection of IKBKE siRNA and its controls， the fold change of expression of IKBKE and the changes of expression levels of TNF-α and IL-6

通过研究新生隐球菌干预THP-1细胞发现，miR-155-5p在6 h时间点表达增加，同时炎性因子TNF-α、IL-6表达明显增加，而IKBKE基因在6 h表达减少，因此推测miR-155-5p通过靶向降解IKBKE mRNA促进TNF-α和IL-6的表达。之后通过双荧光素酶报告系统发现在miR- 155- 5p mimics作用下，IKBKE 3'UTR活性下降，将3'UTR突变其活性再次增加，证实miR-155-5p可与IKBKE 3'UTR结合。随后我们对miR-155-5p功能进行了研究，在miR-155-5p mimics作用下，与对照组比较，实验组在6 h时IKBKE表达降低，TNF-α和IL-6表达明显增加，表明miR-155-5p促进TNF-α、IL-6的表达。为了验证miR-155-5p通过靶向调控IKBKE发挥了此作用，我们将IKBKE siRNA转染至THP-1细胞中，发现在6 h时IKBKE表达减少，同时TNF-α和IL-6表达增加。

综上所述，本研究显示并验证了miR-155-5p通过靶向降解IKBKE mRNA促进TNF-α和IL-6的表达这一调控机制。根据已知研究结果可知TNF-α和IL-6是M1型巨噬细胞分泌的炎性因子，该细胞为促炎类型的巨噬细胞，具有强效杀菌特点并促进辅助性T细胞1型参与的免疫反应（Th1型免疫反应），其在隐球菌性脑膜炎病程中发挥抗感染杀菌作用[5]。因此miR-155-5p可作为隐球菌性脑膜炎潜在的治疗靶点，在临床实践中发挥重要作用。尽管发现IKBKE在隐球菌干预THP-1细胞反应中发挥重要作用，但其作用的炎症通路和具体分子机制仍然不清楚，需要进一步探索和研究。