范张玲， 肖 盟， 王怡倩， 徐英春， 叶长芸， 王焕玲

单核细胞增生李斯特菌（L i s t e r i a monocytogenes， LM）为革兰阳性、兼性胞内寄生菌，可通过食物传播，导致李斯特菌病[1]。目前国际上已有多起LM污染食物引起李斯特菌病暴发的报道，如苹果、香瓜、冰激凌、奶酪、肉食等[2-3]，美国等曾通过实验室分型等方法成功溯源多起暴发，及时召回污染食物，避免更多人群感染[4]。我国不同省份食物中LM检出率约为4.42%，除婴儿食物、烘培食物、鸡蛋外，几乎所有食物中均分离到LM[5]，说明我国有很大的李斯特菌病潜在风险。我国2010-2017年共报道了562例李斯特菌感染病例，而暴发病例报道罕见[6]。

美国等发达国家已将李斯特菌病归为法定传染病，而我国仅部分省市开展了李斯特菌监测工作，李斯特菌病目前在我国尚未引起足够的关注[5]。北京协和医院李斯特菌病患者临床分析数据显示，有44%李斯特菌病患者为医院感染病例[7]。本研究分析了我院18例LM感染患者临床特征，并通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法，对18株LM进行同源性分析，探讨LM感染患者与LM菌株间的相关性，以期提高临床医师对该病的关注和认识。

1 材料与方法

1.1 患者信息及菌株来源

本研究纳入的18株LM均分离自我院2006年1月-2019年4月临床确诊病例，菌株来源包括外周血（11例）、脑脊液（6例）、宫腔拭子（1例）。非妊娠患者出现发热、寒战、腹泻、恶心呕吐、意识改变等LM感染表现；妊娠患者出现发热、流产等LM感染表现。沙门菌标准菌株H9812来自中国疾病预防控制中心。

1.2 主要仪器与试剂

凝胶成像系统GEL Doc XR和PFGE仪CHEF DR-Ⅲ均为美国Bio-Rad公司产品；比浊仪Densimat为法国BioMerieux VITEK公司产品；水浴摇床Grant OLS2000为英国Grant公司产品。

主要试剂有SeaKem Gold Agarose（美国LONZA公司）；蛋白酶K（德国Merck），溶菌酶（美国Sigma），限制性内切酶XbaⅠ、AscⅠ、Apa I（美国NEB）。引物由北京瑞博兴科生物技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 临床李斯特菌病患者数据收集 检索我院临床分离菌株库内的LM菌株，并通过对应患者的病案号检索我院病案室患者资料，收集患者年龄、性别、基础情况、发病时间、感染类型、临床转归等信息。

1.3.2 血清学分型及毒力基因 采用多重PCR方法鉴定菌株的血清型[8]，PCR方法鉴定菌株携带毒力基因情况[9]：inlA（编码内化素A）、ActA（编码肌动蛋白A）、PrfA（编码毒力调节因子转录活化因子）、hly（编码溶毒素LLO）、iap（编码细胞壁水解酶p60）、PlcB（编码磷脂酰胆碱磷脂酶PC-PLC）。所测定的基因及扩增引物见表1，PCR条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s， 53 ℃退火30 s， 72 ℃延伸90 s， 35个循环；72 ℃延伸5 min。取5 μL扩增产物在1.5%琼脂糖中电泳，并观察电泳结果。

1.3.3 PFGE分型 按照美国CDC PulsNet标准操作步骤[10]，用Apa I和Asc I两种酶切LM基因，沙门菌标准菌株H9812使用XbaⅠ酶切；设置电泳参数初始转换时间4 s、终末转换时间40 s、电泳运行19.5 h；用溴化乙锭染色后使用凝胶成像系统Gel Doc XR+拍摄图像，将结果上传至BioNumerics系统进行数据分析，构建聚类树状图。聚类图类型根据非加权配对算术平均法 （UPGMA） 构建。

1.3.4 药敏试验 使用E试验方法（采用法国生物梅里埃公司E试验条），按照临床微生物实验室标准操作流程测定LM菌株对青霉素和美罗培南的敏感性。

2 结果

2.1 患者基本信息

18例李斯特菌病患者的基本信息见表2。其中，妊娠相关病例4例，2例死胎。14例非妊娠相关病例中，男女各7例；年龄19～77岁，其中7例年龄＞50岁；3例预后不良。所有患者均表现发热，以高热为主。

4例妊娠相关病例的孕产妇血培养均有LM生长，临床表现为发热，均未出现神经系统感染症状。第1例新生儿为早产儿，表现为血流感染、脑膜炎，出生后即出现呼吸窘迫综合征，经青霉素联合美罗培南治疗后好转出院。第2例患者孕早期感染LM，发热第2天血培养LM生长，经及时诊断治疗后好转出院。而第13和16例患者，分别为孕中期和孕晚期病例，入院时即诊断为宫内死胎，经引产、治疗后好转出 院。

14例非妊娠相关LM病患者均患有基础疾病，包括自身免疫病7例、肿瘤4例、2型糖尿病2例、心脏病2例。第5、14例患者因病情较重家属放弃治疗，第17例患者因合并开放性肺结核转院后死亡。

2.2 PFGE分型分析

18株LM的PFGE分型结果见图1，共出现13个带型，均为数据库中已有带型。相似度为57.69%～100%。第10、13、16株菌和第1、4株菌虽条带差异度大于1%，但联合Apa I带型和数据库中已有带型分析发现此5株属同一带型，为GX6A16.CN0030，但无明显时间聚集性。第3和第17株菌为同一带型。

2.3 6例入院48 h后起病患者详细特征分析

2.3.1 患者基本情况 6例患者（表2第4、5、7、10、11和12例），4例女性，年龄24～61岁。6例患者均患有基础疾病，3例因自身免疫病住院，2例因血液肿瘤住院，1例因消化道肿瘤入院，血培养均有LM生长，3例表现神经系统感染症状。如表2所示，6例李斯特菌病患者无明显病房聚集性，分布在5个病房。第5例患者因临床表现较重，家属放弃治疗，出院。

2.3.2 血清学分型及毒力基因携带情况 6株临床分离LM株血清及毒力基因携带情况见图2，2株血清型为1/2b（1/2b-3b-7），4株血清型为1/2a（1/2a-3a）。所有菌株的毒力基因inlA、ActA、PrfA、hly、iap均为阳性，而第4、10株菌的毒力基因PlcB阴性。

2.3.3 PFGE分型结果 6株LM的PFGE结果如图1的第4、5、7、10、11、12例结果所示。其中第4和第10号菌株相似度虽小于99%，但结合ApaI图谱和数据库中已有条带分析，将其归为同一带型GX6A16.CN0030。另有3例出现在2010年，但PFGE型别不同。

2.4 药敏试验结果

18株临床分离LM对青霉素和美罗培南敏感率均为100%。

3 讨论

李斯特菌病患者以老年人、孕妇、免疫功能低下者为主[11]，临床表现多较重，可表现为血流感染、脑膜炎、新生儿李斯特菌病等，病死率30%左右[12]。孕妇感染LM临床表现较新生儿轻，多表现为发热和流感样症状，29%产妇没有症状，罕见孕妇脑膜炎或死亡病例报道，而流产、新生儿李斯特菌病发生率较高，新生儿李斯特菌病病死率可达40%[13-14]。本研究4例妊娠相关病例中，2例死胎。14例非妊娠相关病例均患有基础疾病，以自身免疫性疾病为主，7例年龄＞ 50岁。

图2 6例入院48 h后起病患者LM菌株毒力基因及血清型结果Figure 2 Virulence gene and serotype of LM isolates in 6 patients with nosocomial infection

临床研究发现LM感染患者多伴有免疫功能低下等疾病，LM与宿主间相互作用机制尚不清楚，有观点认为免疫功能低下者感染LM更易表现为侵袭性感染，如血流感染、脑膜炎等，但对比患与不患有免疫功能低下疾病的LM感染患者，并未发现发生侵袭性感染的差异[6]。本研究14例非妊娠患者均伴有基础疾病，7例患有自身免疫病，4例患有恶性肿瘤，均表现为侵袭性感染，11例出现神经系统感染症状。对比我国2010-2017年和1996-2010年报道的LM感染病例，发现LM感染病例数显著增加，提示我国李斯特菌感染被低估的可能[6]。韩国亦报道了李斯特菌感染病例较前增加的情况，增加的病例以老年人和伴有基础疾病者为主[15]。

在美国等发达国家，李斯特菌病已被列为法定传染病，由李斯特菌引起的疾病负担在多个国家均有报道分析[15-17]，结合流行病学调查和实验室分型方法已成功溯源多起暴发，避免更多人群感染。我国李斯特菌病尚未被列为法定传染病，报道的病例数有限，不排除低估的可能，暴发病例更是罕见[6]。我国山东省疾控中心在LM感染患者家庭及周边超市、农贸市场、路边快餐等处采集食品类样品并进行菌株分离，结合流行病学调查和PFGE分型等方法，成功溯源三黄鸡为污染源[18]。此外，北京等地区将分离自患者和食物中的LM菌株进行比对，发现临床菌株与分离自周围食物的菌株完全相同[19-20]。

本研究中18例患者的PFGE图谱中，优势图谱为GX6A16.CN0030（27.78%）。分别有5株、2株菌株为同一带型。GX6A16.CN0013、GX6A16.CN0017和GX6A16.CN0030带型临床分离株亦在北京市其他医院报道[20-21]。同为入院48 h后发病的6例患者中，由于本研究为回顾性研究，较难追溯患者流行病学史及可疑食物史，但有2例PFGE图谱虽差异度大于1%，但血清型和毒力基因携带情况一致，不排除医院周围食物污染的可能性。提示应开展医院内LM监测工作，避免免疫力低下人群发生LM感染。

李斯特菌感染多累及老人、孕妇、新生儿和免疫功能低下患者，临床医师需引起重视。当经验用药未果时，需考虑是否为LM感染。目前，青霉素类如青霉素、氨苄西林仍是治疗LM感染的首选药物，该菌对头孢菌素天然耐药。对于青霉素过敏的患者，可首选甲氧苄啶-磺胺甲唑。本组18例感染患者的LM对青霉素和美罗培南高度敏感，无不敏感株。初始经验用药使用头孢菌素类者有7例患者，后改用和加用氨苄西林或青霉素和/或磺胺类，有些患者加用了亚胺培南，患者治愈和好转。因此若抗菌药物使用合理，感染预后良 好。