陈强 章正祥 戚观树 周会霞 邵敏峰 黄春华

不安腿综合征（restless legs syndrome，RLS），是一种常见的睡眠障碍疾病，以静息状态下双下肢感觉异常和强烈的活动愿望为主，严重影响睡眠和生活质量。其发病机制尚不明确，目前研究发现多巴胺机制功能障碍是RLS的重要原因［1］。临床上用DRD2/DRD3受体激动剂可有效控制RLS症状。脊髓通过多巴胺来调节运动和感觉传导，下丘脑A11核团是脊髓灰质中下行多巴胺通路的主要来源［2］。临床上通过提高5-HT生物利用度来治疗抑郁的同时，会引起或加重患者的RLS发作［3］，并发现激活5HT1B/1D受体可使运动活性提高［4］。本研究通过毁损下丘脑A11区多巴胺神经元制备RLS大鼠模型，在此基础上进一步探索多巴胺D2受体与5HT1B受体是否共同参与RLS的调控。

1 材料与方法

1.1 组织来源 SPF级雄性SD大鼠15只，250～350g。由浙江中医药大学动物实验中心提供，上海西普尔-必凯实验动物有限公司生产。根据体重随机分成3组，模型组（n=6）、假手术组（n=6）、空白组（n=3）。麻醉后以前囟为定位标志，对右侧A11进行定位钻孔（前囟尾侧3.0mm，腹侧8.1mm，矢状缝右侧0.5mm）。进针后毁损组注射4μl 0.2% 6-OHDA（含0.1%抗坏血酸），假手术组注射4μl 0.1%抗坏血酸生理盐水，空白组不进行任何处理。各组在第8天录制6h行为学视频后，通过心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛磷酸缓冲液，取大鼠脑组织，在4℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液中再固定12～24h，然后用4℃30%蔗糖-PBS液脱水72h，于液氮中速冻10～15s左右，存于-80℃冰箱。

1.2 主要试剂 兔抗大鼠D2多克隆抗体（324393），Calbiochem；山羊源5-HT1B受体抗体（Sc-32545），Santa Cruz；Cy3标记的山羊抗兔IgG（H+L）（WDA0516），Fitc标记的驴抗山羊IgG（H+L）（WD-RAG001），由达文生物有限公司进口美国杰克逊公司后提供；DAPI Fluoromount-G（0100-20），SouthernBiotech。

1.3 仪器 冰冻切片机（HM 550），德国美康仪器设备有限公司；激光共聚焦荧光显微镜（SP8），徕卡。

1.4 免疫荧光 （1）切片制备：根据《大鼠脑立体定位图谱》（第6版）对中脑导水管周围灰质（PAG）进行定位。每组各随机抽取1个，在-20℃的恒温箱中连续切片，PAG切片厚度为20μm，每个样本取1张切片，收集于0.01M PBS液中，于4℃保存。（2）免疫荧光双染漂片法：脑片收集于0.01M PBS液中，在摇床上漂洗10min；将脑片转移至盛有0.01M PBS液的96孔板中，吸去PBS液后加入免疫染色封闭液，置于37℃水浴箱封闭1.5h；吸去封闭液后，加入兔源多巴胺D2受体一抗（稀释度为1：500），置于4℃冰箱孵育过夜；置于37℃水浴箱复温1h；PBS液摇床漂洗10min，共4次；吸去PBS液，加入1∶100 Goat anti-rabbit IgG（H+L）Cy3，置于37℃水浴箱孵育2h，此步后续操作均应注意避光；PBS液摇床漂洗10min，共4次；吸去PBS液，加入山羊源5-HT受体一抗（稀释度为1∶50），置于4℃冰箱孵育过夜；置于37℃水浴箱复温1h；PBS液摇床漂洗10min，共4次；吸去PBS液，加入1∶50 Donkey anti-Goat IgG（H+L）Fitc，置于37℃水浴箱孵育2h；PBS液摇床漂洗10min，共4次；将脑片裱于载玻片上，室温下待脑片表面液体阴干后，滴加少量含DAPI的封片剂，盖上盖玻片。（3）图片分析：激光共聚焦荧光显微镜拍片，每张玻片输出四个图片，Cy3标记的二抗结合DRD2，显示为红色。Fitc标记的二抗结合的5HT1BR，显示为绿色。DAPI染色细胞核，为蓝色。同一个细胞共同表达DRD2和5HT1BR，混合显示为棕黄色。

2 结果

免疫荧光双染结果显示PAG同时存在多巴胺D2受体、5HT1B受体，共存于同一细胞，见图1-6。

图1-1 模型组-PAG 5HT1BR（×100）；图1-2模型组-PAG DRD2（×100）图1-3模型组-PAG DAPI（×100）；图1-4模型组-PAG 合并（×100）

图2-1 模型组-PAG右侧5HT1BR（×630）；图2-2模型组-PAG右侧DRD2（×630）；图2-3模型组-PAG右侧DAPI（×630）；图2-4模型组-PAG右侧合并（×630）

图3-1 假手术组-PAG5HT1BR（×100）；图3-2假手术组-PAG DRD2（×100）；图3-3假手术组-PAG DAPI（×100）；图3-4假手术组-PAG 合并（×100）

图3-1 假手术组-PAG5HT1BR（×100）；图3-2假手术组-PAG DRD2（×100）；图3-3假手术组-PAG DAPI（×100）；图3-4假手术组-PAG 合并（×100）

图5-1 空白组-PAG 5HT1BR（×100）；图5-2空白组-PAG DRD2（×100）；图5-3空白组-PAG DAPI（×100）；图5-4空白组-PAG 合并（×100）

图6-1 空白组-PAG右侧5HT1BR（×630）；图6-2空白组-PAG右侧DRD2（×630）；图6-3空白组-PAG右侧DAPI（×630）；图6-4空白组-PAG右侧 合并（×630）

3 讨论

3.1 多巴胺受体在RLS中的核心作用 多巴胺受体有多种类型，其中多巴胺D2受体（DRD2）、多巴胺D3受体（DRD3）和RLS关系最密切。A11神经元的激活降低了对有害刺激的行为反应，这种作用是由D2型受体介导的［5］。目前普遍认为RLS患者的主要病理机制为低活性多巴胺能神经传递，对脊髓背角抗伤害行为反应抑制减弱。临床实践中已得到证实，大部分患者对多巴胺能治疗有效，服用多巴胺能拮抗剂症状恶化［6］，多巴胺能药物治疗RLS症状的短期改善由D2和D3受体介导［7］。对RLS患者进行PET检查发现中脑边缘的DRD2明显减少［8］。

3.2 5HT受体对RLS的影响 5HT通过不同的受体亚型起作用，对背角的伤害性传播发挥复杂的调节作用。其中5-HT1受体的激活产生抗伤害感受作用，5-HT 1B/1D受体减少单突触和多突触反射途径中的感觉传播［9］。背角的5HT来源于延髓头端腹内侧结构（RVMM）的神经元，而RVMM神经元主要接受PAG的5-HT神经元投射［5］。通过激活多巴胺D2样受体可增加5-HT神经元的活性，这不仅发生在中缝背核中，还可能存在于PAG［10］。有研究［11］发现不仅腹侧中脑导水管周围灰质的多巴胺能神经元在促进觉醒中发挥着重要作用，使用5-HT1B受体激动剂也能促进觉醒。Mccreary等［4］通过动物实验发现5-HT 1B/1D受体拮抗剂可以通过拮抗在纹状体和/或边缘区域中的5-HT 1B/1D，导致DA释放增强，活动减少。Shioda等［12］用5-HT1A受体激动剂坦度螺酮成功改善RLS患者的症状，可能是因为5-HT1A受体激动剂间接增加脑内多巴胺浓度［13］从而起到治疗作用。

综上所述，五羟色胺能神经系统与多巴胺能神经系统关系密切，共同调节不安腿综合征的症状。本研究发现PAG共同表达多巴胺D2受体与5HT1B受体，两者可能通过协同控制多巴胺能神经传递来调控RLS，但尚需实验进一步证实。