俎峰 赵凯琴 张云云 田正书 刘亚俊 奚俊玉 束正齐 符明联

摘要：【目的】对甘蓝型油菜花期和生育期QTL进行定位，为精细定位和克隆早花基因及开展分子标记辅助早熟油菜品种选育提供理论依据。【方法】以极早熟甘蓝型油菜G28、甘蓝型油菜H008及以二者为亲本构建的175个F1DH株系为材料，利用甘蓝型油菜60K SNP芯片分型技术绘制高密度遗传连锁图谱，并采用完备复合区间作图法对2016─2017年度丽江和临沧2个生长环境下甘蓝型油菜的花期（FT）和生育期（MT）田间调查数据进行QTL扫描分析。【结果】F1DH株系花期与生育期具有较明显的超亲现象，表明雙亲材料控制花期和生育期的位点不同。F1DH株系在丽江生长环境下花期与生育期相关系数为0.63，在临沧生长环境下二者相关系数为0.79，即花期与生育期呈较高的正相关。利用SNP芯片构建的高密度遗传连锁图谱共包含19条连锁群，7601个SNPs位点，总长3838.2 cM。在丽江和临沧2个生长环境下共检测到6个花期QTL和5个生育期QTL，分布于A02、A07、C02、C03、C06、C07和C09连锁群上，可分别解释2.96%～17.40%和4.98%～11.82%的遗传变异。花期QTL qFTA02-1和qFTC03-2在2生长个环境下均可检测到，加性效应值相反，其中qFTA02-1具有最高的LOD值（20.43）、贡献率（17.40%）和加性效应值（3.27 d），且与生育期QTL qMTA02-1置信区间重叠，是最主要的花期主效QTL;qFTC03-2为次要的花期主效QTL。在qFTA02-1置信区间内发现2个拟南芥花期调控关键基因FLC和FY的油菜同源基因拷贝BnaA02g00370D和BnaA02g01670D。【结论】花期主效QTL qFTA02-1和qFTC03-2可用于分子标记辅助选育早熟油菜品种。BnaA02g00370D和BnaA02g01670D可能为qFTA02-1置信区间内控制甘蓝型油菜花期性状的目标基因。

关键词： 甘蓝型油菜;花期;生育期;QTL定位;SNP芯片

中图分类号： S634.303.6        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0500-06

0 引言

【研究意义】油菜（Brassica napus）是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物（陈盛等，2017;徐文等，2018）。花期（Flower time，FT）与生育期（Maturity time，MT）高度正相关是油菜早熟性状选择的重要指标（Zhao et al.，2005;倪正斌等，2018），但二者作为数量性状由多基因控制，且与环境的互作效应显著（关周博等，2016;蔡东芳等，2017），在无分子标记辅助的情况下较难实现直接选择。因此，开展油菜花期与生育期的数量性状座位（QTL）定位研究，以实现分子标记辅助选择早熟性状，对提高早熟油菜品种选育效率具有重要意义。【前人研究进展】大量研究表明，油菜花期与生育期具有较高的遗传力，适宜开展QTL定位研究（Zhao et al.，2005;Long et al.，2007;关周博等，2016;黄吉祥等，2016;姜成红等，2017）。1995年，Ferreira等首次利用甘蓝型油菜DH群体构建的RFLP标记遗传连锁图谱检测花期QTL，在LG9（A09）连锁群检测到1个在3个生长环境下均稳定出现的QTL，贡献率高达28%。Zhao等（2005）利用甘蓝型油菜SG-DH群体构建的SSR标记遗传连锁图谱检测花期和成熟期QTL，在3个生长环境下共检测到7个主效QTL，分别位于A01、A02、C01、C02、C04、C06和C09连锁群上，其中A01、C02和C06连锁群上的花期QTL与成熟期QTL区间重叠或一致。Long等（2007）利用甘蓝型油菜TN-DH群体及其衍生的RCF2群体构建电泳标记遗传连锁图谱，在11个生长环境下累计检测到42个花期QTL，分布于绝大部分连锁群上，其中A10和C06连锁群上的QTL贡献率最大，不同环境下可分别解释26%～52%的遗传变异，并证实qFT10-4区间内拟南芥花期关键基因FLC的甘蓝型油菜同源基因拷贝BnFLC10是油菜品种冬、春性分化的关键基因。黄吉祥等（2016）利用分子标记加密甘蓝型油菜SG-DH群体构建的遗传连锁图谱检测9个生长环境下的花期QTL，共检测到7个在3个生长环境下稳定出现的花期QTL，QTL加性效应值为0.58～3.85 d，累计解释遗传变异的84%，其中位于A02、C02和C06连锁群上的3个QTL效应值最大。【本研究切入点】虽然前人已针对油菜花期与生育期开展了大量QTL定位研究，但油菜生长环境多为平原或低海拔地区，至今鲜见有关高海拔生长环境下油菜花期与生育期QTL定位的研究报道。【拟解决的关键问题】利用甘蓝型油菜60K SNP芯片分型技术（Raman et al.，2014）绘制F1DH株系群体的高密度遗传连锁图谱，采用完备复合区间作图法对丽江（海拔1819.5 m）和临沧（海拔2378.8 m）试验点的F1DH株系群体花期和生育期田间调查数据进行QTL扫描分析，并分析推测主效QTL位点内的候选基因，旨在解析高海拔地区甘蓝型油菜花期和生育期性状遗传规律，最终实现花期和生育期性状主效QTL定位，为今后精细定位和克隆早花基因及开展分子标记辅助早熟油菜品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为极早熟甘蓝型油菜种质G28、早熟甘蓝型油菜种质H008及以G28为母本、H008为父本构建的175个F1DH株系，种子由云南省农业科学院经济作物研究所油菜中心提供。DNA提取试剂盒DP350购自天根生化科技（北京）有限公司;甘蓝型油菜60K SNP芯片及配套试剂（Brassica 60K_Cons_ ParkinAAFC）购自美国Illumina公司;SNP芯片分型试验平台购自美国Illumina公司。

1. 2 田间种植及花期和生育期测定

2016年10月，175份F1DH株系及其亲本分别播种于云南省临沧市博尚镇勐准村（东经100º03'19"，北纬23º43'03"，海拔1819.50 m）和丽江市玉龙县黄山镇长水村（东经100º11'59"、北纬26º51'54"，海拔2378.8 m）2个试验点（以下简称临沧试验点和丽江试验点）。随机区组排列，设2次重复。5叶期每行定植10～12株，行距30 cm，株距20 cm，田间管理按照试验点当地的高产栽培措施进行。2017年4─5月按照各株系成熟度分批收獲。

花期和生育期2个性状的测定方法：初花时间判定标准为一行材料中30%植株开第一朵花的时间，播种到该时间点的间隔记为花期;成熟时间判定标准为一行材料中70%植株角果呈黄色、籽粒呈黑色的时间，播种到该时间点的间隔记为生育期。

1. 3 DNA提取

将175个F1DH株系及其双亲（G28和H008）种子置于光照培养箱进行发芽，子叶平展时进行单株取样。采用DNA提取试剂盒提取样品DNA，并以琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-20 ℃保存备用。

1. 4 SNP芯片分析

利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室油菜研究团队的SNP芯片分型试验平台，参照甘蓝型油菜60K SNP芯片及配套试剂产品说明对供试材料进行SNP芯片基因分型试验。

1. 5 遗传连锁图谱构建与QTL分析

利用JoinMap 4.0与MSTMap综合计算F1DH株系内SNP位点间遗传距离，绘制遗传连锁图谱。利用IciMapping 4.1中的ICIM-ADD模型对2016─2017年度F1DH株系在临沧和丽江试验点的花期和生育期2个性状田间调查数据进行QTL扫描分析，参数设置为Missing Phenotype：Deletion;Step：1.00;LOD值：3.0（Meng et al.，2015）。不同生长环境下检测到的同一性状QTL置信区间（1-LOD）内重叠则视为同一QTL，重叠部分为置信区间。QTL命名采用“q+性状英文首字母大写缩写（花期即FT;生育期即MT）+连锁群编号+QTL个数”。如甘蓝型油菜第1连锁群上的第一个控制花期的QTL命名为qFTA01-1。

1. 6 SNP芯片探针序列BLAST分析

从NCBI网站上下载甘蓝型油菜参考基因组（Darmor-bzh）和CDS序列V4.1版及拟南芥参考基因组序列TAIR10版。利用blast+2.7.1软件包的makeblastdb命令搭建甘蓝型油菜参考基因组、CDS和拟南芥基因组的本地化数据库，参数设为-hash_index， -parse_seqids和-dbtype nucl。使用blastn命令提交SNP芯片探针序列到本地化数据库进行BLAST分析，参数设为-evalue e-18、-num_alignments 1、 -outfmt 6及50个探针碱基序列中仅允许有1个碱基错配。最后使用blastdbcmd命令提取基因序列。

2 结果与分析

2. 1 F1DH株系及其双亲的花期和生育期测定结果

175个F1DH株系及其双亲的花期与生育期测定结果如表1所示。双亲材料（G28和H008）在丽江和临沧试验点的花期分别相差32和28 d，生育期分别相差30和16 d;F1DH株系在这两个试验点的花期最小值间相差29 d，最大值间相差31 d，生育期最小值间相差33 d，最大值间相差17 d。可见，在丽江和临沧2个生长环境下，F1DH株系的花期和生育期具有较明显的超亲现象，表明双亲材料控制花期和生育期的位点不同。通过计算性状间相关系数可知，F1DH株系在丽江试验点花期与生育期相关系数为0.63，在临沧环境下二者相关系数为0.79，表明花期与生育期呈较高的正相关。

2. 2 遗传连锁图谱构建及花期和生育期QTL分析结果

由175个F1DH株系及其双亲的SNP芯片基因分型试验结果可知，双亲材料（G28和H008）间有20183个SNPs位点。对175份DH株系SNP数据进行评估后，利用JoinMap 4.0与MSTmap构建甘蓝型油菜高密度遗传连锁图谱。该遗传连锁图谱包含19条连锁群，7601个SNPs位点，总长3838.2 cM。

利用IciMapping 4.1中的ICIM-ADD模型在2个生长环境（丽江和临沧）下共检测到8个花期QTL，其中丽江试验点6个，临沧试验点2个，可解释2.96%～17.40%（即贡献率，下同）的遗传变异;共检测到5个生育期QTL，其中丽江试验点4个，临沧试验点1个，可解释4.98%～11.82%的遗传变异。8个花期QTL分别分布在A02（3个）、C03（3个）、C07（1个）和C09（1个）连锁群上，其中，分布在A02连锁群上的3个花期QTL中有2个QTL的置信区间完全一致，合并为1个QTL，分布在C03连锁群上的3个花期OTL中有2个花期QTL的置信区间重叠，合并为1个QTL，故最终获得6个花期QTL，分别命名为qFTA02-1、qFTA02-2、qFTC03-2、qFTC03-1、qFTC07-1和qFTC09-1。5个生育期QTL分别分布在A02、A07、C02、C03和C06连锁群上，命名为qMTA02-1、qMTA07-1、qMTC02-1、qMTC03-1和qMTC06-1。值得关注的是位于A02连锁群上的qFTA02-1置信区间与qMTA02-1相重叠（表2）。综上所述，在丽江和临沧2个生长环境下均检测到2个稳定出现的花期QTL即qFTA02-1和qFTC03-2，加性效应值相反，但未检测到稳定出现的生育期QTL，其中qFTA02-1具有最高的LOD值、加性效应值和贡献率，且置信区间与qMTA02-1相重叠，推测qFTA02-1是最主要的花期主效QTL，qFTC03-2为次要的花期主效QTL。

2. 3 花期主效QTL qFTA02-1的物理图谱映射及候选基因分析结果

由表2可知，qFTA02-1在丽江和临沧2个生长环境下均可检测到，其LOD值最高可达20.43，可解释高达17.40%的遗传变异，加性效应值也高达3.27 d，且与qMTA02-1置信区间重叠，是花期性状最主效QTL。提交qFTA02-1两侧SNP标记（Bn-A02-p1264906和Bn-A02-p3344176）探针序列到本地化数据库，BLAST比对分析结果显示，qFTA02-1置信区间位于参考基因组A02染色体0.11～0.84 M（表3）。依据参考基因组注释信息发现，该置信区间内存在260个基因，将基因序列提交至本地化拟南芥基因数据库进行BLAST比对分析，发现BnaA02g00370D和BnaA02g01670D分别与拟南芥花期控制基因FLC（AT5G10140）和FY（AT5G13480）高度同源，序列相似度高达89.61%和89.62%，将二者命名为BnFLC-A2和BnFY-A2，可作为花期QTL qFTA02-1置信区间内的候选基因进行深入研究。

3 讨论

本研究发现在丽江和临沧2个生长环境下双亲材料（G28和H008）花期分别相差32和28 d，生育期分别相差30和16 d;F1DH株系在这两个试验点花期相差29～31 d，生育期相差17～33 d，其原因可能是丽江与临沧的自然环境差异较大，与黄吉祥等（2016）的研究结果相似。黄吉祥等（2016）在9个生长环境下对油菜F1DH株系及其亲本的花期进行调查，结果发现晚熟亲本2001年在德国生长环境下的花期与2013年在我国杭州生长环境下的花期相差59 d，早熟亲本2001年在德国生长环境下的花期与2007年在我国杭州生长环境下的花期相差69 d。由此可见，虽然大量研究证实植物的花期和生育期遗传力较高（Zhao et al.，2005;Long et al.，2007），但二者作为数量性状仍受自然环境的严重影响。

QTL定位是结合性状表型数据，利用分子标记技术将控制数量性状的基因或基因簇作为一个整体定位到连锁群上，并估计其遗传效应，结果准确性主要由性状的遗传复杂度与性状表型数据的准确性共同决定（李慧慧等，2010;任照彬等，2018）。本研究在丽江和临沧2个生长环境下检测到2个稳定出现的花期QTL（qFTA02-1和qFTC03-2），但未检测到稳定出现的生育期QTL。这可能与田间测定生育期的标准（70%植株角果皮呈黄色、籽粒呈黑色）易受主观因素影响，而花期判定标准（30%植株开出第一朵花）易分辨，受主观因素影响较小。此外，虽然花期与生育期高度正相关（Zhao et al.，2005;关周博等，2016），是早熟性状选择的重要指标，但初花过后应还有其他基因参与植株的生殖生长发育进程，与花期相比，生育期遗传更复杂。因此，在今后QTL定位研究中需尽可能分解性状，量化性状判定指标，从而降低性状的遗传复杂度，减少主观因素影响，提高性状判定的准确度，有助于检测出稳定的QTL。

对模式植物拟南芥功能基因组学研究较深入，基因注释信息详尽，能为同为十字花科的油菜相关研究提供丰富参考信息（Parkin et al.，2005;王钊辉等，2017）。甘蓝型油菜参考基因组序列的公布有助于研究人员在QTL定位后通过BLAST比对查询QTL置信区间内拟南芥基因的油菜同源基因拷贝。Xu等（2016）利用SNP芯片技术对523个甘蓝型油菜品系进行花期性状全基因组关联分析，结果检测到41个与油菜花期显著关联的SNP，提取最显著关联SNP位点两侧的油菜基因组序列到拟南芥基因组数据库进行BLAST比对分析，发现距离该SNP位点13 kb的位置存在一个重要的拟南芥光周期控制基因CONSTANS（CO）的同源基因拷贝BnaC09g41990D。本研究利用上述相同的研究思路，在qFTA02-1置信区间内发现2个控制拟南芥花期基因（FLC和FY）的油菜同源基因拷贝BnaA02g00370D和BnaA02g01670D，命名为BnFLC-A2与BnFY-A2。FLC作为春化途径中的关键基因，编码MADS-box基因家族转录因子，负向调控开花性状，晚花植株低温春化前FLC基因高效表达会抑制植株开花，春化后FLC基因甲基化，表达水平下降，植株开花（Sanda and Amasino 1996;Helliwell et al.，2006）。该基因在大白菜和甘蓝型油菜上的同源基因拷贝功能与拟南芥FLC基因功能相似，均能调控植株花期（Kim et al.，2007;Hou et al.，2012）。FY是花期自主調控途径的重要基因，编码mRNA编辑因子，对FLC基因具有双向调控功能，通过抑制或诱导FLC基因表达以调控开花时间（Feng and Michaels，2011）。但目前鲜见有关FY基因油菜同源基因拷贝的研究报道。推测FLC和FY基因的油菜同源基因拷贝BnaA02g00370D和BnaA02g01670D均为qFTA02-1置信区间内控制甘蓝型油菜花期性状的目标基因，需进行深入研究。

4 结论

花期主效QTL qFTA02-1和qFTC03-2可用于分子标记辅助选育早熟油菜品种。BnaA02g00370D和BnaA02g01670D可能为qFTA02-1置信区间内控制甘蓝型油菜花期性状的目标基因。

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（責任编辑 陈 燕）