焦迪 谢婉 潘鹏丞 陈宝剑 关志惠 杨秀荣 兰干球 郭亚芬 谢炳坤

摘要：【目的】克隆陆川猪肌球蛋白调节轻链9基因（MYL9），并进行生物信息学分析及检测其在不同猪种中的表达差异，为明确陆川猪骨骼肌生长规律及研究MYL9的生理功能打下基础。【方法】根据NCBI上的家猪MYL9基因序列设计特异性引物，采用RT-PCR克隆陆川猪MYL9基因，利用在线软件对其进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测陆川猪和杜洛克猪背最长肌中MYL9基因的表达情况。【结果】陆川猪MYL9基因编码区（CDS）序列长519 bp，共编码172个氨基酸;与NCBI上已公布的家猪MYL9基因（NM_001244472.1）CDS序列比对，陆川猪MYL9基因存在2处碱基突变，分别是195 bp处C→A和498 bp处T→C，均为同义突变;陆川猪MYL9基因推导氨基酸序列与家猪MYL9基因推导氨基酸序列的同源性最高，为99.6%，與鸡的同源性最低，为88.4%。陆川猪MYL9蛋白存在3个N糖基化位点和15个磷酸化位点，不存在跨膜结构域和信号肽，符合一般EFh-PEF超家族的结构特征。陆川猪MYL9蛋白二级结构中α-螺旋占54.65%，无规则卷曲占35.47%，β-转角占8.14%，延伸链占1.74%。MYL9基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于陆川猪背最长肌（P<0.01）。【结论】MYL9基因序列在不同物种中具有较高的保守性，其在10周龄陆川猪背最长肌中的相对表达量极显著低于杜洛克猪，与其在不同猪种背最长肌中的磷酸化程度有关，也说明MYL9基因对猪肌肉生长速度有一定影响。

关键词： 陆川猪;肌球蛋白轻链9基因（MYL9）;克隆;生物信息学分析;肌肉;磷酸化

中图分类号： S828.89                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0454-07

0 引言

【研究意义】陆川猪是我国八大地方优良猪种之一，具有抗病力强、繁殖力高、肉嫩味鲜等优点（黄艳娜等，2014a，2014b）。目前，国内已有针对陆川猪肉质性状等表观指标的研究报道。张家富等（2010）对陆川猪的胴体品质和肉质进行研究，何若钢等（2011）对杜洛克与陆川猪杂交后代的肉质进行研究，刘明君等（2018）对陆川猪与杜洛克杂交猪的屠宰性能和肉质性状进行分析，但鲜见有关陆川猪优质肉质性状形成分子机制的研究报道。因此，加强陆川猪肌肉相关基因的研究对提高其肉质性状具有重要意义。【前人研究进展】肌球蛋白调节轻链9（Myosin light chain 9，MYL9）又称LC20或MYRL2，是肌球蛋白结构中调节肌球蛋白活性的调节性轻链，由MYL9或MLC2基因编码，作为肌动蛋白依赖性的分子马达，可利用ATP水解产生的能量沿肌动蛋白运动（黄亚强，2015）。已有研究表明，通过对MYL9磷酸化或去磷酸化进而有效调控物质运输、有丝分裂、肌肉运动、细胞器运动、细胞质流动、细胞迁移、细胞内吞、胞外分泌和信号传导等过程（Krendel and Mooseker，2005）。通过NCBI搜索可知，人类的MYL9基因位于20p11.23，含有4个外显子，基因编号为10398;猪的MYL9基因位于第17号染色体上，也含有4个外显子，基因编号为100157760。在人类的正常组织和肿瘤组织中MYL9基因均有表达，如膀胱癌、结肠癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌等（王永勇等，2017）。Conti等（2004）研究发现，MYL9缺失的老鼠胚胎成胚后7.5 d即死亡且其内胚层瓦解，在细胞间连接中起重要作用的钙黏素也出现缺失，说明MYL9是正常老鼠胚胎细胞间聚集及黏附所必需的成分。王丛阳等（2010）研究表明，通过对MYL9磷酸化或去磷酸化的调节可影响肌球蛋白活性，诱导细胞凋亡、分化和迁移，对肿瘤的增殖、侵袭和迁移发挥重要作用。Shehadeh等（2011）研究发现，通过肌球蛋白轻链激酶（Myosin light chain kinase，MLCK）系统和Rho激酶（Rho-kinase，ROCK）系统可激活MYL9，从而提升细胞増殖分化和迁移黏附能力，并促使形成应力纤维及驱动肌球蛋白收缩。此外，作为血管平滑肌收缩和细胞黏附信号的中转环节，MYL9在血管平滑肌收缩维持血管张力和血压平稳中发挥重要作用，若将该基因阻断则血管平滑肌收缩及细胞黏附遭到破坏（黄亚强，2015）。Zeng等（2005）研究发现内皮细胞中的MYL9在磷酸化作用下调节内皮细胞骨架重塑，并增加内皮细胞收缩，促进细胞间隙的形成和内皮通透性。Licht等（2010）通过老鼠动脉试验证实MYL9基因是JUNB的靶基因，JUNB和MYL9在血管平滑肌的表达量下调导致血管失去收缩性，而丧失调节血压稳定的作用。Shehadeh等（2011）研究发现，MYL9基因是受损大鼠动脉中唯一随内皮层年龄增长而上调的基因，且MYL9基因表达量上调可能与血管通透性的增加有关。【本研究切入点】综上所述，MYL9基因与肌肉收缩、细胞增殖和信号传导等密切相关，且对机体生长发育有一定的调控作用，但目前针对陆川猪MYL9基因的相关研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以陆川猪背最长肌为材料，克隆MYL9基因并对其序列、蛋白结构及功能进行分析预测，对比MYL9基因在陆川猪和杜洛克猪背最长肌中的表达量差异，为明确陆川猪骨骼肌生长规律及研究MYL9的生理功能打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

陆川猪和杜洛克猪由广西畜牧研究所提供，10周龄，各3头。反转录试剂盒、定量试剂盒、pMD18-T载体、TRIzol试剂和Premix Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司;胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司;Trans 5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;琼脂糖购自Biowest公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 PCR引物设计与合成 根据NCBI中的猪MYL9基因序列（NM_001244472.1），利用Oligo 7.0和Primer Premier 6.0设计特异性引物（表1），包括克隆引物（MYL9-F1和MYL9-R1）、定量引物（MYL9-F2和MYL9-R2）及内参基因引物（GAPDH-F和GAPDH-R）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 2 陆川猪MYL9基因克隆 以TRIzol法提取的陆川猪背最长肌总RNA为模板合成cDNA，再以MYL9-F1和MYL9-R1为引物、cDNA为模板扩增陆川猪MYL9基因。PCR反应体系10.0 µL：Premix Taq DNA聚合酶5.0 µL，cDNA模板1.0 µL，MYL9-F1和MYL9-R1各0.4 µL，RNase free ddH2O 3.2 µL。扩增程序：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环。扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收目的片段，与pMD18-T载体连接后转化Trans 5α感受态细胞，挑取单克隆菌落培养，菌液经PCR验证后挑取阳性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 2. 3 实时荧光定量PCR 采用TRIzol法提取陆川猪和杜洛克猪背最长肌总RNA，反转录合成cDNA，以GAPDH为内参基因进行实时荧光定量PCR检测。反应体系20.0 µL：SYBR Green Master Mix 10.0 µL，cDNA模板5.0 µL，上、下游引物各0.5 µL，RNase free ddH2O 4.0 µL。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行39个循环。每个样本重复3次，采用2-ΔΔCt法换算基因相对表达量。

1. 3 陆川猪MYL9基因序列及其生物信息学分析

采用ProtParam（https：//web.expasy.org/protpa-ram/）对陆川猪MYL9基因进行基本理化性质预测;以DNASTAR比对不同物种间MYL9基因氨基酸序列差异，包括与NCBI上已公布的家猪（NM_001244472.1）、小鼠（NM_172118.1）、大鼠（NM_001100885.1）、牛（NM_001075234.1）、人类（NM_006097.5）和鸡（NM_205278.1）的亲缘关系。以Prabi服务器的SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）对陆川猪MYL9蛋白二级结构进行预测，以SWISS-MODEL（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）对其三级结构进行预测。采用ExPASy中的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）进行陆川猪MYL9蛋白亲/疏水性分析，分别以NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对其潜在磷酸化位点、保守特异蛋白激酶位点、潜在N糖基化位点、跨膜区及蛋白信号肽进行分析。使用PSORT中的K-NN计算程序（https：//psort.hgc.jp/）对陆川猪MYL9蛋白亚细胞分布情况进行检测，以NCBI上的CDD对MYL9蛋白的保守结构域进行检测。

2 结果与分析

2. 1 陆川猪MYL9基因扩增结果

采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果显示在700 bp附近出现单一、清晰的目的条带，与预期结果相符。

2. 2 陆川猪MYL9基因序列及生物信息学分析结果

2. 2. 1 陆川猪MYL9基因序列 陆川猪MYL9基因编码区（CDS）序列长519 bp，共编码172个氨基酸。测序结果与NCBI上已公布的家猪MYL9基因（NM_001244472.1）CDS序列进行比对，发现陆川猪MYL9基因存在2处碱基突变，分别是195 bp处C→A和498 bp处T→C，均为同义突变。运用DNASTAR对陆川猪MYL9基因推导氨基酸序列與NCBI上已公布家猪、小鼠、大鼠、牛、人类和鸡的MYL9基因推导氨基酸序列进行同源性比对分析，发现其与家猪的同源性最高（99.6%），与小鼠、大鼠、牛和人类的同源性也在90.0%以上，依次为92.5%、92.1%、95.2%和94.0%，与鸡的同源性仅88.4%。基于MYL9基因CDS序列同源性构建的系统发育进化树也显示，陆川猪与家猪的亲缘关系最近，而与鸡的亲缘关系相对较远。

2. 2. 2 陆川猪MYL9蛋白理化性质 应用ProtParam分析发现，陆川猪MYL9蛋白分子量19.83 kD，理论等电点（pI）4.67，pH为7.0时电荷为-11.42，N端残基为蛋氨酸。在172个编码氨基酸中，天冬氨酸占10.47%、谷氨酸占9.88%、赖氨酸占8.14%和苯丙氨酸占8.14%;23个强碱性氨基酸占总氨基酸的13.37%，35个强酸性氨基酸占总氨基酸的20.35%，48个疏水性氨基酸占总氨基酸的27.91%，36个极性氨基酸占总氨基酸的20.93%。由于陆川猪MYL9蛋白疏水性氨基酸和极性氨基酸所占比例较高，而有利于其外分泌。陆川猪MYL9蛋白在体外的理论半衰期为30 h，不稳定系数为35.45，表明其理化性质稳定。

2. 2. 3 陆川猪MYL9蛋白二级和三级结构 应用Prabi服务器的SOPMA程序预测陆川猪MYL9蛋白二级结构，结果显示，α-螺旋（以h表示）占54.65%，无规则卷曲（以c表示）占35.47%，β-转角（以字母t表示）占8.14%，延伸链（以e表示）占1.74%。应用SWISS-MODEL平台预测陆川猪MYL9蛋白三级结构，发现陆川猪MYL9蛋白可能存在的三级结构有3种模型。

2. 2. 4 陆川猪MYL9蛋白亲/疏水性 应用ProtScale程序预测陆川猪MYL9蛋白的亲/疏水性，结果显示，陆川猪MYL9蛋白在第87位丙氨酸疏水值最大（1.578），第13位精氨酸疏水值最小（-3.022）。陆川猪MYL9蛋白具有较强的亲水性。

2. 2. 5 陆川猪MYL9蛋白信号肽及蛋白跨膜区 应用SignalP 4.1预测分析陆川猪MYL9蛋白信号肽，结果显示陆川猪MYL9蛋白没有信号肽，不是分泌型蛋白。TMHMM Server 2.0对陆川猪MYL9蛋白的跨膜区预测结果显示，陆川猪MYL9蛋白不存在跨膜结构。

2. 2. 6 陆川猪MYL9蛋白修饰结构 应用NetNGlyc 1.0对陆川猪MYL9蛋白N糖基化位点进行分析，结果显示，陆川猪MYL9蛋白第64、82和95位氨基酸处各存在1个N糖基化位点。以NetPhos 3.1 Server对陆川猪MYL9蛋白磷酸化位点进行分析，结果发现陆川猪MYL9蛋白第2、3、20、29、60和115位为丝氨酸，第10、11、19、97、135和160位为苏氨酸，第69、143和156位为酪氨酸，以上位点均可被磷酸化。15个磷酸化位点对应的各自磷酸激酶预测结果显示，在陆川猪MYL9蛋白上可能存在PKC、unsp、DNAPK和CKII 4种保守的蛋白激酶结合位点，且以unsp位点的分值最高，为0.946。

2. 2. 7 陆川猪MYL9蛋白亚细胞定位及功能域 应用PSORT中的K-NN计算程序对陆川猪MYL9蛋白亚细胞定位进行预测，结果显示，细胞质占13.5%、线粒体占13.0%、细胞骨架占10.0%、细胞核占5.5%。陆川猪MYL9蛋白保守结构域预测结果显示，陆川猪MYL9蛋白含有1个保守的功能域（FRQ1），即EFh-PEF超家族，位于第19～169位氨基酸。

2. 3 陆川猪和杜洛克猪背最长肌MYL9基因表达差异

实时荧光定量PCR分别检测MYL9基因在10周龄陆川猪和杜洛克猪背最长肌中的表达情况，结果显示，MYL9基因在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中的相对表达量分别为1.79±0.31和6.61±0.25，二者差异极显著（P<0.01）。

3 讨论

Gilles等（2009）研究发现，MAL/SRF复合物通过调节MYL9和MMP9而参与血小板形成及巨核细胞迁移。Jalagadugula等（2010）研究发现，MYL9受巨核细胞和血小板中转录因子RUNX1的调控，RUNX1突变会造成血小板肌球蛋白轻链磷酸化，MYL9转录水平降低，血小板减少，说明MYL9与先天性血小板减少症有关。Zhang等（2015）研究发现，MYL9与启动子相互作用并能激活心肌细胞中黄嘌呤氧化酶转录，是一种潜在的治疗心脏缺血/再灌注损伤的新治疗靶点。可见，MYL9参与了细胞增殖、信号传导等重要生物学过程，但目前关于陆川猪MYL9基因的研究鲜见报道。为此，本研究从陆川猪背最长肌中克隆MYL9基因并进行生物信息学分析，对比MYL9基因在陆川猪和杜洛克猪背肌中的表达差异，以期为揭示MYL9的作用机制提供理论依据。

通过NCBI数据库查询可知，MYL9基因在人类、小鼠、鸡和牛中共编码172个氨基酸，在大鼠中编码171个氨基酸，即不同物种MYL9基因所编码的氨基酸个数差别很小，说明MYL9在不同物种中具有较高的保守性。陆川猪MYL9蛋白具有典型保守结构域FRQ1，属于EFh-PEF超家族，说明MYL9蛋白是免疫球蛋白家族成员之一。陆川猪MYL9蛋白无跨膜结构，也不存在信号肽，暗示MYL9蛋白不是分泌型蛋白，与亚细胞定位预测结果吻合。MYL9蛋白的磷酸化位点及激酶预测分析结果表明，陆川猪MYL9蛋白存在PKC、unsp、DNAPK和CKII 4种保守的蛋白激酶结合位点，可能与MYL9通过调节MLCK和ROCK激酶活性及肌动蛋白收缩性，进而调节细胞的增殖、迁移和黏附能力有关。Hong等（2011）研究发现，MLCK作为一种钙调素依赖激酶，可磷酸化MYL9而激活肌球蛋白的ATP活性，释放能量，进而促进内皮细胞骨架重塑，对应力纤维形成、驱动肌球蛋白收缩及细胞增殖等过程均起促进作用。本研究还发现，杜洛克猪背最长肌中的MYL9基因相对表达量极显著高于陆川猪背最长肌，可能与陆川猪肌肉生长缓慢，而杜洛克猪肌肉生长迅速相关，说明MYL9基因對影响猪肌肉生长速度有一定作用。

综上所述，陆川猪肌肉生长缓慢、瘦肉率低，可能是MYL9磷酸化水平影响陆川猪肌肉生长，也可能是MYL9在磷酸化作用下调节细胞骨架重塑，并增加内皮细胞收缩、细胞间隙形成及内皮通透性而影响信号传导所致。

4 结论

MYL9基因序列在不同物种中具有较高的保守性，其在10周龄陆川猪背最长肌中的相对表达量极显著低于杜洛克猪，与其在不同猪种背最长肌中的磷酸化程度有关，也说明MYL9基因对猪肌肉生长速度有一定影响。

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（責任编辑 兰宗宝）