马晓楠 张玲 王娜伟 郑舒月 赵贺杰 赵思婷 张妮 马宁宁

摘要：单克隆抗体（mAbs）是一种复杂的大分子蛋白，存在不稳定性现象。本文回顾了与单克隆抗体不稳定性相关的机制以及影响其稳定性的参数和条件（包括蛋白质结构、浓度、温度和光照等），然后提出了用于理化稳定性和生物稳定性研究的不同分析方法，为单抗类药物在临床使用中达到更稳定的效果提供了一定的实际指导意义。

关键词：单克隆抗体;蛋白质;稳定性研究

【中图分类号】R-01【文献标识码】A【文章编号】2107-2306（2019）05-148-02

1.前言

自从1986年第一种单克隆抗体药物Muromonab通过FDA的批准进入市场以来，单抗已经成为生物制药领域中最重要的组成部分。单抗类药物因其研发周期长、投入成本高，在专利期内受到保护，一旦专利期到，就会有许多其他公司加入到开发和生产的行列中23。

治疗性抗体在利用CHO等哺乳动物细胞进行生产的过程中由于多种参数可能出现的变化，最终也可能引起重组蛋白的改变，如无法使用完全相同的细胞株克隆，培养条件和使用辅料的变化、长期培养过程中细胞株遗传信息的不稳定性等，再加上抗体这样的复杂蛋白不可避免地具有微异质性和不同的翻译后修饰，都使得要对蛋白稳定性进行评估成为一个复杂的过程。

本文首先描述了影響单克隆抗体稳定性的相关机制与因素，然后列出了用于研究稳定性的不同分析方法，旨在为单克隆抗体的生产与临床应用提供具有实际指导意义的信息。

2.单抗的不稳定性机制

蛋白质降解可能由多种不同机制引起，通常分为化学不稳定性和物理不稳定性。这些不稳定性并非单独存在，而是紧密关联——化学反应可能导致物理不稳定性，而物理不稳定性也会缩小能相互作用的残基之间的距离，进而影响其化学性质。

2.1化学不稳定性

氧化，如二硫键的形成，是发生在抗体分子中最常见的化学反应之一。它既可以由氧化剂（如过氧化物、光或金属）的存在导致，也可以自发产生。有一些残基很容易被氧化，包括蛋氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基，二硫键的形成就是半胱氨酸氧化的结果之一。

蛋白质的另一个主要化学降解过程是脱酰胺化（天冬酰胺与谷氨酰胺）18。当该过程发生在天冬酰胺时，琥珀酰亚胺中间体能够自发水解生成天冬氨酸或异天冬氨酸5。单克隆抗体也可能在二硫键或肽链上发生裂解。二硫键断裂可导致抗体的片段化（如单链抗体）。肽键的断裂可由酶或非酶机制引发并形成不同性质和大小的低分子量片段，铰链区域也很容易发生切割13。

单克隆抗体化学修饰的影响在很大程度上取决于修饰发生的位置7。例如，Fc片段中的脱酰胺作用可能影响很小，而如果位于Fab片段的CDR中，则可能导致结合亲和力和单抗效力的降低7。氧化也可能产生同样的结果，如果位于Fc片段，可能降低与FcRn和巨噬细胞的结合亲和力2。此外，一些研究表明，化学不稳定性会导致构象的改变和聚集12。例如Burkitt等人的研究显示，蛋氨酸氧化易使二级结构稳定性降低3。

2.2物理不稳定

蛋白质的变性是指蛋白质的高级结构通过去折叠而丧失。这既可能是由于先前描述的化学不稳定性，也可能由环境条件，如极端温度或pH值造成。聚集是主要的物理不稳定性10，由最初的天然蛋白质组装成高分子量多聚体。聚集体由弱的非特异性键（范德华力、氢键、疏水性和静电相互作用）组成，一级结构并不发生变化16。结果可导致可溶性或不溶性沉淀聚合物的形成。聚集往往是不可逆的，特别是在后期，聚集物往往含有高水平的非天然构象的蛋白质6.。

3.稳定性的影响因素

3.1蛋白质结构

蛋白质的各级结构都能对其稳定性产生影响。氨基酸序列对决定蛋白质是否容易聚集具有重要作用。例如，CDR的低等电点似乎通过增强单克隆抗体之间的静电相互作用来促进可溶性多聚体的形成，而CDR的高等电点则优先导致不溶性聚集体的形成，特别是在与带负电荷的表面接触时8。

mAb序列和结构的细微变化也会显著影响其在不同压力条件下的稳定性。Pisupati等人在一项强制降解研究中比较了英夫利昔单抗（Remicade®）和其生物类似物（Remsima®）的性质，发现尽管产品的外形和制造工艺存在细微差异，但初级序列是影响稳定性的主要因素19。此外，残基上的黏附物（如聚糖），特别是易聚集的黏附物，可能会降低整个mAb的聚集趋势17。三级结构对聚集也有巨大的影响，这取决于展开的程度，因为一些研究表明，部分展开的蛋白质比天然和完全展开的蛋白质更容易发生聚集6。

3.2蛋白质浓度

高蛋白浓度已被证明会影响聚集。较高的蛋白质浓度似乎也会增加溶液的黏度，而溶液本身可能通过增强蛋白质之间的相互作用和自我结合来增加蛋白质的聚集潜能21，22。考虑到皮下给药需要高浓度的单克隆抗体，这种依赖浓度的聚集趋势是一个被日益关注的问题。

3.3温度

高温可以扰乱天然蛋白质的构象，促进聚集现象的出现，提高蛋白质的聚合速率6，甚至导致不可逆的构象变化16。

低温可能引起蛋白质变性，特别是在冷冻和冻融循环过程中，这与多种压力因素（结晶导致的缓冲液pH值下降、溶质分子低温浓缩、水冰界面形成等）的组合有关，从而影响蛋白质的胶体和构象稳定性14。

3.4光

mAb药物在制备过程中的许多阶段都会暴露在光下。例如，生产过程中，通常用柱层析法纯化，然后（短暂地）暴露于检测器的紫外线下，在储存和患者给药期间是其主要暴露于光的阶段。蛋白质，尤其是它们的芳香残基，对光非常敏感，通过光氧化和氧自由基的形成诱导光降解，或者出现断裂和交联11。含有大量芳香残基（尤其是色氨酸残基）的抗体对这种现象特别敏感，由此证实了紫外线比白光的影响更大。液体形式似乎也比冻干形式更敏感9。不仅是单抗，配方中的辅料也可能发生光降解。多聚物的光降解通过自发氧化作用发生，并可导致过氧化物的形成，从而加剧氧化过程4，15，。

4.单抗稳定性的研究方法

单抗药物的稳定性是一个比小分子药物更复杂的问题，不能仅仅根据稳定的浓度或没有降解产物来定义，还必须包括对不稳定性临界点的完整评估20。应包括三个主要方面的评估：（1）物理稳定性：研究聚合、分裂以及抗体结构;（2）化学稳定性：检测是否出现化学退化（如之前所述）;（3）生物稳定性：证实单抗在达到其理化稳定性时能够保持其生物活性。这是一项具有挑战性的工作，因为不同的测定评估方法可能会导致不一致的结果，例如在聚合测定过程中由不同技术度量范围导致的测量结果不同16。

ICH生物技术产品稳定性评价指南给出了生物活性测定、分子实体分析和纯度分析（降解产物定量检测）。其他参数也应监测（例如视觉外观、pH值等）。药品评价应至少对3个不同批次进行20。欧洲已经发表了关于抗癌药物稳定性研究的共识，特别是关于蛋白质药物，包括单克隆抗体1。为了研究物理不稳定性，应该使用几种正交技术，至少包括比浊法和SEC，但也推荐其他技术，如圆二色谱。为了研究化学不稳定性，至少使用3种分离技术，推荐使用离子交换色谱、SEC和肽图分析。生物稳定性应采用免疫或细胞毒性测定法进行评估，但仅作为一种补充试验，其结果不应被视为总体稳定性的自我证据，因为相同的生物活性并不意味着整个结构的完全一致1。

綜上所述，了解并建立对单抗药物稳定性评价的机制对于其在临床使用中达到更稳定的效果具有重要的实践指导意义。

参考文献

1.BardinC，AstierA，VultoA.Guidelinesforthepracticalstabilitystudiesofanticancerdrugs：aEuropeanconsensusconference.AnnPharFr.2011;69（4）：221-231.

2.BerrillA，BiddlecombeJ，BracewellD.Productqualityduringmanufactureandsupply.In：Peptideandproteindelivery.Amsterdam，theNetherlands：Elsevier;2011：313-339.

3.BurkittW，DomannP，O’ConnorG.Conformationalchangesinoxidativelystressedmonoclonalantibodiesstudiesbyhydrogenexchangemassspectrometry.ProteinSci.2010;19（4）：826-835.

4.BorisovOV，JiJA，JohnWang.Oxidativedegradationofpolysorbatesurfactantsstudiedbyliquidchromatography-massspectrometry.JPharmSci.2015;104（3）：1005-1018.

5.CheliusD，RehderDS.Identificationandcharacterizationofdeamidationsitesintheconservedregionsofhumanimmunoglobulingammaantibodies.AnaChem.2005;77（18）：6004-6011.

6.ChiEY，KrishnanS，RandopphTW.Physicalstabilityofproteinsinaqueoussolution：mechanismanddrigingforcesinnonnativeproteinaggregation.PharmRes.2003;20（9）：1325-1336.

7.DuY，WalshA，EhrichR.Chromatographicanalysisoftheacidicandbasicspeciesofrecombinantmonoclonalantibodies.Mabs.2012;4（5）：578-585.

8.FukudaJ，IwuraT，/YanagiharaS.Factorstogovernsolubleandinsolubleaggregate-formationinmonoclonalantibodies.AnalSci.2015;31（12）：1233-1240.

9.KerwinBA，RemmeleRL，Protectfromlight：photodegradationandproteinbiologics.JPharmSci.2007;96（6）：1468-1479.

10.LahlouA，BlanchetB.Mechanically-inducedaggregationofthemonoclonalantibodycetuximab.AnnPharmFr.2009;67（5）：340-352.

11.LeiM，QuanC，WangYJ.Light-inducedcovalentbufferadductstohistidineinamodelprotein.PharRes.2018;35（3）：67.

12.LiS，NguyenTH，XchoneichC.Aggregationandprecipitationofhumanrelaxininducedbymetal-catalyzedoxidation.Biochemistry.1995;34（17）：5762-5772.

13.LiuH，Gaza-BulsecoG，SunJ.CharacterizationofthestabilityofafullyhumanmonoclonalIgGafterprolongedincubationatelevatedtemperature.JChromatogrBAnalytTechnoloBiomedLifeSci，2006;837（1-2）：35-43.

14.LiuL，BraunLJ，WangW.Freezing-inducedperturbationoftertiarystructureofamonoclonalantibody.JPharmSci.2014;103（7）：1979-1986.

15.LuisLM，HuY，ZamiriC.DeterminationoftheacceptableAmbientlightexposureauringdrugproductmanufacturingforlong-termstabilityofmonoclonalantibodies.PDAJPharmSciTechnol.2018;72（4）：393-403.

16.MahlerH-C，FriessW，GrauschopfU，KieseS.Proteinaggregation：pathways，inductionfactorsandanalysis.JPharmSci.2009;98（9）：2909-2934.

17.NakamuraH，Oda-UedaN，OhkuriT.IntroductionofaglycosylationsiteintheconstantregiondecreasestheaggregationofadalimumanFab.BiochemBiophysResCommun.2018;503（2）：752-756.

18.PaulM，VieillardV，JaccouletE.Long-termstabilityofdilutedsolutionsofthemonoclonalantibodyrituximan.IntJPharm.2012;436（1-2）：282-290.

19.PisupatiK，BenetA，TianY.Biosimilarityunderstress：aforceddegradationstudyofRemicade®andRemsima?.Mabs.2017;9（7）：1197-1209.

20.QualityofBiotechnologicalProducts：StabilityTestingofBiotechnological/BiologicalProducts（Q5C）.InternationalCouncilforHarmonisationofTechnicalRequirementsforPharmaceuticalforHumanUse.1995.AccessedSeptember24，2019.

21.SchermeyerM-T，WollAK，KokkeB.Characterizationofhighlyconcentratedantibodysolution-atoolboxforthedescriptionofproteinlong-termsolutionstability.Mabs.20179（7）：1169-1185.

22.UchiyamaS.Liquidformulationforantibodydrugs.BiochimBiophysActa.2014;1844（11）：2041-2052.

23.YoannLeBasle，PhilipChennell，NicolasTokhadze.PhysicochemicalStabilityofMonoclonalAntibodies：AReview.JPharmSci.2019：1-22

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