廖世杰 李波香 冯文宇 刘云 罗恺 丁晓飞 赵劲民

[ 摘要] 目的 研究中药单体鹰嘴豆芽素 A 对Perthes 病股骨头畸形、对破骨细胞分化以及破骨细胞功能的影响，以找寻治疗和预防该病的药物。方法 建立股骨头缺血性坏死动物模型，鹰嘴豆芽素 A 干预后观察股骨头形态学改变。不同浓度鹰嘴豆芽素A 干预 RANKL 诱导的破骨细胞分化，TRAP 染色后观察破骨细胞数量改变，RT-PCR 检测 TRAP、MMP-9 水平。结果 鹰嘴豆芽素 A 可以缓解股骨头缺血性坏死后畸形，抑制破骨细胞的形成以及标志基因 TRAP、MMP-9 表达。结论 鹰嘴豆芽素 A 可以预防股骨头缺血性坏死，是可预防股骨头缺血性坏死后畸形的潜在药物。

关键词：鹰嘴豆芽素 A;儿童股骨头缺血性坏死;破骨细胞;中药单体

【中图分类号】R816.8 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）05-010-03

股骨頭缺血性坏死（ischemic osteonecrosis of the femoral head ，ONFH）可发生于成人或儿童中，是由各种原因造成股骨头缺血后发生的髋部疾患。Legg-Calvé-Perthes disease，简称 Perthes 病，是发生于儿童的特发性股骨头缺血性坏死 [1]。

股骨头骨骺缺血坏死愈合后可遗留不同程度畸形，严重影响儿童的身心健康，是青年髋关节置换的主要原因之一 [2] 。

股骨头缺血坏死后破骨细胞异常激活和随之而来的局部骨溶解是股骨头骨骺畸形愈合的重要原因 [3-5]。骨髓来源的造血祖细胞在多种细胞因子的刺激下向坏死区迁移形成破骨细胞，执行骨吸收功能。鹰嘴豆芽素 A 主要来源于鹰嘴豆芽素豆、红车轴草全草，属于黄酮类天然化合物。鹰嘴豆芽素有许多药理特性，如：抗氧化、抗炎及抗肿瘤等 [6]。既往研究表明，鹰嘴豆芽素 A 可通过抑制破骨细胞的活化来改善绝经后骨质疏松症。但儿童股骨头缺血性坏死破骨细胞分化的机制与骨质疏松症不完全相同，本研究通过体内及体外实验探究鹰嘴豆芽素A 对Perthes 病股骨头骨骺畸形愈合的预防作用。                                                               1 材料与方法

1.1 动物和实验材料

本实验使用雄性 Sprague-Dawley 大鼠（8 周龄，广西医科大学动物实验中心，中国）。大鼠在 SPF 级动物房中饲养，可自由活动、获取食物和水。鹰嘴豆芽素 A（纯度> 99% ， 购自成都曼斯特生物科技有限公司）， 溶于二甲基亚砜（Aladdin 试剂公司）。培养基 α-MEM 和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于 Gibco BRL。重组可溶性巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和重组小鼠可溶性 RANKL 购于美国R&D公司。CCK-8 购自Beyotime生物技术研究所。 TRAP染色试剂盒购于Sigma-Aldrich。其他化学品购自 Sigma 公司。

1.2 实验设计

该实验得到广西医科大学伦理委员会批准。 12 只大鼠随机分为 4 组：假手术组（Sham，n = 6），骨坏死组（ON， n = 6），鹰嘴豆芽素 A 治疗的骨坏死组（ON + 鹰嘴豆芽素 A，n = 6）。动物模型的建立，采用经典的股骨颈环扎法 [7，8]。简而言之，在麻醉后，在右侧股骨大转子上方的皮肤上纵向切开皮肤，分离臀大肌和臀中肌以暴露关节囊。打开关节囊，用不可吸收线结扎股骨颈（# 3-0 Vicryl， Ethicon）。股骨头复位后，逐层缝合肌肉和皮肤。假手术组仅解剖关节囊，不结扎股骨颈。手术后，鹰嘴豆芽素 A

组隔天腹腔注射鹰嘴豆芽素 A（ 5 mg / kg），持续 4 周。假手术组和骨坏死组予相同剂量的 PBS。术后 4 周对所有动物实施安乐死。造模侧股骨头取材后用拍照观察。

1.3 骨髓来源巨噬细胞（BMMs）提取                                 4 周龄大的 C57BL 小鼠用于提取造血祖细胞。对小鼠

实行安乐死后，分离出小鼠股骨和胫骨，剪刀剪去两端骨骺后，使用装满完全培养基的注射器将骨髓细胞从骨髓腔内冲出，即为骨髓造血祖细胞。 随后将这些细胞转移至

T75 培养瓶中，并加入含有 MCSF（30ng/mL）、10% FBS 的 α-MEM 的培养液，细胞在 37℃的 5% CO2 培养箱中培养 （ 下同 ）。即可得到 BMMs。

1.4 破骨细胞分化实验

将 BMMs 从 T75 中消化下来后， 按 6×103 / 孔的密度转移到 96 孔板中，使用完全培养基（含有 MCSF30 ng/ mL、RANKL 100 ng/mL 和 10% FBS 的 α-MEM 的培养液 ， 下同） 进行培养。 按鹰嘴豆芽素 A 浓度（0，2.5，5，10 和20μM）进行分组，并设置不加 RANKL 的阴性对照組。按上述培养条件孵育细胞，隔天换液至 7 天，显微镜下观

察出现 3 个核及以上巨噬细胞即判断为破骨细胞。此时用PBS 清洗培养液并用 4% 多聚甲醛固定细胞。避光条件下使用TRAP 染色试剂盒染色15 分钟。随后下显微镜下拍照， 超过三个细胞核并且 TRAP 染色阳性即为破骨细胞，记录其数量和总细胞数。

1.5 细胞毒性实验

使用 CCK-8 试剂盒来检测不同浓度鹰嘴豆芽素 A 对BMMs 的细胞毒性作用。 按 6×103 细胞密度，使用完全α-MEM 培养基将细胞种于 96 孔板中，按鹰嘴豆芽素浓度分组（0，2.5，5.0，10，20 和 40μM），每个分组有 3 个副孔。培养 48 小时后，按 CCK8 说明书要求，向每个孔中加入 10μL CCK-8 缓冲液，按要求培养 4 小时。 使用吸光度酶标仪（Infinite M1000 PRO，Tecan）在 450nm 下测量每个孔的吸光度。

1.6 聚合酶链式反应 （PCR）

将上述 BMMs 按 1. 2×105 个细胞 / 每孔种入 6 孔板中， 用含 30 ng /mL M CSF 和 100 ng /mL RANKL 的培养液培养，并用鹰嘴豆芽素 A（0，5，10 和 20μM） 干预。上述条件培养细胞，每 48 小时换液至第 5 天。当显微镜下观察到鹰嘴豆芽素 （ 0μM） 出现大而融合的破骨细胞时，即用Trizol 将细胞裂解，按相关操作说明提取总 RNA，再将总RNA 逆转录成 cDNA。然后，使用 Real - Time PCR 仪器检测 ACP5 （ TRAP ）、MMP9 基因的扩增情况。序列。

1.7 统计学分析

数据表示为平均值 ± 标准偏差（SD）。 用独立样本

t 检验（对于两组）或单向 ANOVA（对于两组以上）分析数据。通过Pearson 相关系数检验进行参数间的相关分析。假设统计学显着性为 P < 0.05。 星号（*，** 和 ***）分别代表 P < 0.05，P < 0.01 和 P < 0.001。

2.1 鹰嘴豆芽素 A 可改善股骨头缺血性坏死后股骨头

畸形

股骨头骨骺血供中断是 Perthes 病发病的中心环节，我们采用经典的股骨颈环扎法建立动物模型。建模后 4 周， 与假手术组大鼠相比，骨坏死组大鼠股骨头外观呈明显扁平状畸形，股骨头骨骺出现骨坏死（图 1 A，B）。结果与以往文献报道一致。与假手术组比较，鹰嘴豆芽素 A 治疗组股骨头骨骺稍扁平，但是畸形程度较缺血性骨坏死组大鼠轻（图 1 A，B 和 C）。大体观结果初步提示鹰嘴豆芽素

A 可改善股骨头缺血性坏死后畸形。

2.2 鹰嘴豆芽素 A 抑制破骨细胞分化

目前研究表明，破骨细胞过度活化促进了股骨头坏死后畸形愈合，因此我们进行体外实验：观察鹰嘴豆芽素 A 对破骨细胞分化的影响。如图 2-A 所示，阴性对照组中未看到 TRAP 阳性破骨细胞。阳性对照组中清楚地观察到大量 TRAP 阳性破骨细胞，不同浓度的鹰嘴豆芽素 A 处理后破骨细胞的数量有明显差异（图 2-B）。我们对各个分组进行破骨细胞进行计算。结果表明，20μM 组破骨细胞数为98.68±6.642 / 孔，显著低于10.00μM 组（147±4.509 / 孔）、

5.00μM 组（172±9.074 / 孔）、2.5μM 组（265±5.508/ 孔） 和对照组（271.3±11.22/ 孔）（图 2-A）。统计学分析表明， 组间的差异具有统计学差异（图 2 B）。因此，鹰嘴豆芽素

A 可抑制 RANKL 诱导的破骨细胞分化，抑制程度与药物浓度呈正相关。

2.3 鹰嘴豆芽素 A 对破骨细胞没有细胞毒性

为了排除是否鹰嘴豆芽素 A 对破骨细胞细胞毒性导致破骨细胞数量减低，我们进行了 CCK-8 试验。结果表明， 高浓度的药物有显著细胞毒性，但本研究中， 鹰嘴豆芽素

A 刺激 BMMs 48 小时后，使用的药物浓度（0，2.5，5.0，10，

20 和 40μM）对 BMMs 活性没有显著的细胞毒性作（图 2

C）。 这些结果表明，鹰嘴豆芽素抑制破骨细胞分化时没有明显的细胞毒性。

2.4 鹰嘴豆芽素 A 抑制破骨细胞特异性基因转录

破骨细胞分化过程中可表达一些标志性基因，例如MMP-9， TRAP。TRAP 是破骨细胞分化的特异性基因，而MMP-9 在骨吸收是发挥重要作用。在该实验中，将 BMMs 分成 3 组：对照组，用 RANKL 诱导的 BMMs 和用 RANKL 诱导并用鹰嘴豆芽素A 处理的BMMs。鹰嘴豆芽素 A（5，10 和20μM）可以抑制RANKL 诱导的MMP-9，TRAP 的转录， 与对照组（鹰嘴豆芽素 A 0μM）相比有统计学差异。

骨坏死区破骨细胞过度活化及造成的骨溶解，是

Perthes 病股骨头骨骺畸形愈合的主要原因。因此，抑制破骨细胞分化可作为预防股骨头股骨头骨骺畸形愈合的潜在非手术方法。我们的体内实验表明，鹰嘴豆芽素 A 治疗组可改善股骨头缺血性坏死后畸形。体外实验结果表明，鹰嘴豆芽素 A 可在无细胞毒性的浓度范围内抑制破骨细胞分化，可抑制破骨细胞分化特异性基因 TRAP 和MMP9 转录。因此，鹰嘴豆芽素 A 可作为改善股骨头缺血性坏死后畸形的潜在天然活性药物。

股骨头缺血性坏死后病理改变促进了破骨细胞分化， 这些因素包括坏死物质持续存在 [3，5]，髋关节滑膜液中

IL-6、IL-17 显著升高 [4]。这些条件共同构成了持续的骨坏死区慢性炎性改变。该环境下细胞因子可通过直接或间接途径刺激 RANK、RANKL 表达而使得破骨细胞持续过度激活 [9]。其结果是造成股骨头骨小梁过度吸收、力学强度下降和股骨头骨骺塌陷，最终形成股骨头扁平状畸形 [10]。因此，抑制破骨细胞分化理论上可预防股骨头骨骺畸形。

Kim 等 [11，12] 研究发现抑制 IL-6 表达或者竞争性拮抗 IL-6 受体都可通过抑制破骨细胞分化缓解股骨头畸形。直接使用 RANKL 受体单抗，动物体内实验证明具有治疗 Perthes 病的效果 [13]。鹰嘴豆芽素 A 作为黄酮类化合物，可通过抑制破骨细胞的分化而改善绝经后骨质疏松症的骨量丢失。但其在股骨头缺血性坏死中的作用也未得到研究。我们的体内实验表明，股骨头坏死组股骨头呈扁平状畸形，有明显的骨坏死。尽管较假手术组仍有畸形，但使用鹰嘴豆芽素 A 治疗后，畸形程度可得到缓解。进一步体外实验表明，在破骨细胞分化期间不同浓度的鹰嘴豆芽素 A 可降低

TRAP 染色阳性破骨细胞形成。而且这种效果呈浓度是呈浓度依赖的，CCK-8 实验表明该药物浓度下没有细胞毒性。该结果和以往的研究结果类似。

破骨细胞分化过程中，RANKL 与其受体 RANK 结合后，可激活下游一系列信号通路，包括 MAPK 信号通路、NF-κB[14，15]。这些信号通路在破骨细胞分化的作用不同， 但是均可促进 c-FOS，NFATc1 转录因子的表达，进而促进破骨细胞内特异性基因的表达，经过转录和翻译而发挥功能 [16]。TRAP 是破骨细胞分化中最特异性基因，其表达抗酒石酸酸性磷酸酶，该蛋白是破骨细胞分化的特异性蛋白。MMP-9 即金属基质蛋白酶 9，其属于金属基质蛋白酶家族， 其在骨吸收中的作用是讲解细胞外基质 [17]。我们的体内实验表明，在抑制破骨细胞分化的浓度范围内，鹰嘴豆芽素

A 可抑制 TRAP、MMP-9 的表达，该结果进一步解释了鹰嘴豆芽素 A 抑制破骨细胞分化的机制。

鹰嘴豆芽素 A 可改善股骨头缺血性坏死后畸形，其可能的机制是抑制破骨细胞分化。因此，鹰嘴豆芽素 A 可作为一种潜在的药物用于改善股骨头缺血性坏死后畸形。

• Kuroyanagi G， Adapala NS， Yamaguchi R， et al. Interleukin-6 deletion stimulates revascularization and new bone formation following ischemic osteonecrosis in a murine model[J]. Bone， 2018， 116： 221-231.

1946-1954.

[ 基 金 项 目 ]  广 西 研 究 生 教 育 创 新 计 划 项 目

（YCBZ2018035）， 廣 西 自 然 基 金 青 年 科 学 基 金 项 目

（2018GXNSFBA281090）， 广 西 医 科 大 学 大 学 生 创 新课 题（201910598259）， 广 西 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目（2017GXNSFAA198305）

[ 作者简介] 廖世杰（1985-），男，广西梧州人，在读博士， 主治医师，主要从事创伤骨科、手外科及小儿骨科工作。

[ 通讯作者 ] 赵劲民，E-mail： zhaojinmin@126.com