戴枫 黄国鑫 徐忠世

摘要：目的 通过测量大鼠椎体及股骨骨密度、股骨生物应力数据及显微镜下观察股骨骨小梁微观结构，对比研究分析外源性 H2S 供体 GYY4137 及双膦酸盐类代表药物阿仑膦酸钠对去势大鼠骨质疏松症的治疗效果。方法 通过切除大鼠双侧卵巢建立经典的骨质疏松模型，模拟围绝经期妇女雌激素骤减、神经内分泌紊乱所致的骨质疏松疾病过程，大鼠随机分组通过腹腔注射 GYY4137 或阿仑膦酸钠进行干预，使用改良亚甲蓝法测定血浆硫化氢浓度，使用双能 X 射线骨密度仪测量第

4、5 腰椎椎体及股骨骨密度;通过股骨三点弯曲实验测量股骨骨折最大应力值。所有数据由 SPSS 22.0 软件处理分析。同时在显微镜下微观定性对比观察各组大鼠股骨 H&E  染色切片骨小梁分布情况。结果  去势大鼠骨质疏松模型下，腹腔注射

GYY4137 模拟内源性 H2S 可提高了血浆 H2S 浓度，在显微镜下观察到股骨骨小梁微观结构的明显改善，与阿仑膦酸钠治疗组无明显差异，在各个时间段 GYY4137 和阿仑膦酸钠干预组在第 4、5 腰椎骨密度及股骨最大应力负荷测量数据上同正常对照组无统计学意义上的差别（p>0.05）。在第 12 周，大鼠第 4 腰椎骨密度和大鼠股骨骨密度在 GYY4137 干预组较 OVX 实验对照组有增加（p<0.05）。结论 GYY4137 作为近年热点研究的一种新型 H2S 缓释供体，在实验中和阿仑膦酸钠的干预效果类同，对去势大鼠骨质疏松症的治疗有效。

关键词：雌激素;骨质疏松;H2S;骨密度;最大应力;去卵巢

【中图分类号】R681 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）05-005-03

骨质疏松伴随骨量减少和骨脆性增加，极易造成骨折和伤残等并发症，严重影响患者的身体健康和生活质量， 甚至缩短患者寿命 [1]。骨质疏松最常发生于绝经后妇女， 被称为绝经后骨质疏松症 （PMOP） [2]，雌激素和多种内源性激素在体内调节影响着骨代谢，补充外源性激素进行替代治疗是目前常用的治疗手段之一，但同时增加了患者生殖系统肿瘤的风险 [3]。在研究中，我们选取了去卵巢大鼠这一经典实验模型来模拟绝经后骨质疏松的病理过程。证實了外源性腹腔注射 GYY4137 可以提高大鼠血浆的 H2S 浓度水平，提高了大鼠腰椎及股骨骨密度数据，抵消反转了因雌激素缺乏所致对骨代谢的相关影响，微观上股骨 HE 染色的镜下观察也佐证了干预治疗效果，GYY4137 干预下

OVX 大鼠股骨骨小梁的微观结构和正常对照组及阿仑膦酸钠干预组相差无几。

1.1 试剂和化学物质

GYY4137 购买于 Santa Cruz Biotechnology （SC-224013）， 使用 0.9% 的生理盐水稀释。

阿伦瞵酸钠（阿拉丁，A115345），同样使用 0.9% 的生理盐水稀释。

水合氯醛（Sangon Biotech， Shanghai， China）

青霉素、戊巴比妥钠、生理盐水等均购于正规国内生产厂商。

1.2 动物实验材料和方法

80 只 6 月龄 SPF 级雌性 SD 大鼠，体重 265±15g，购于广东省实验动物中心。大鼠适应性饲养 1 周后进行分组和骨质疏松造模，随机分为正常对照组（sham-GYY）、实验对照组 （OVX-vehicle）、GYY4137（GYY）干预组 （OVX-

GYY） 和阿伦瞵酸钠干预组 （OVX-ALEN）。每组 20 只;其中实验对照组、GYY4137（GYY）干预组和阿伦瞵酸钠干预组进行骨质疏松造模，大鼠使用 320mg/kg 剂量水合氯醛麻醉后，腹部开口，完整摘除双侧卵巢（ovariectomy，

OVX），关腹。正常对照组大鼠进行假手术处理：大鼠开腹后分离卵巢组织，关腹，不做卵巢切除术 ， 手术过程中动物无大出血。术后待大鼠自然清醒，青霉素（4 万U/ 只） 治疗 3 天避免感染。术后，正常对照组大鼠腹腔注 100μg/ kg GYY4137（santa cruz，sc-224013），实验对照组大鼠腹

腔注射 1mg/kg 生理盐水，阿伦瞵酸钠干预组大鼠皮下注射 1mg/kg 阿仑膦酸钠（ 阿拉丁，A115345），GYY4137 干预组大鼠腹腔注射 100μg/kg GYY4137（santa cruz，sc-

224013），用药次数均为 2 天 / 次。于给药 2、4、8、12 周后每组各 5 只大鼠使用戊巴比妥钠注射麻醉，腹主动脉采血，分离血浆。于给药 2、4、8、12 周后每组各处死 5 只大鼠，完整取出双侧股骨，剔除软组织和附件。于给药 8、

12 周后完整取出各组大鼠腰椎体，同样剔除软组织和附件， 仅仅保留椎体。股骨和腰椎椎体用浸透生理盐水的纱布包裹后，分组标记保存于-80℃冰箱中。大鼠由专人饲养，在温度 23±2℃，相对湿度 55±10% 以及昼夜交替各 12 小时

的受控条件下，自由进食和饮水。实验期为 12 周，实验过程中没有大鼠意外死亡。以上所有的实验步骤均严格按照中国科技部的《实验动物的管理和使用指南》进行。

1.3 血浆 H2S 浓度检测

改良亚甲基蓝法测定血浆硫化氢，先加过量醋酸锌溶液使血浆中游离 H2S、HS-、S2- 形成 ZnS 沉淀; 再加入5mol/L NaOH 强碱溶解变性的蛋白;离心去除大量蛋白质; 再加入 0.2% N，N- 二甲基对苯二胺盐酸盐溶液使 ZnS 完全溶解，用三氯乙酸沉淀剩余蛋白质，最后用分光光度计法测定 H2S 浓度。

1.4 H&E 染 色 （Hematoxylin-eosin staining）

在 4% 浓度的多聚甲醛固定后，股骨样品脱钙，然后再递增浓度的乙醇中脱水，再二甲苯中清洗并植入组织学石蜡中，使用厚度为 5μm 切片进行 H&E 染色。

1.5 骨密度检测

骨密度检测使用美国产 Hologic 双能 X 射线 4500W 骨密度仪（DEXA）分次测定第 4、第 5 腰椎椎体和双侧股骨骨密度（BMD）。

1.6 生物力学检测

取股骨样本进行生物力学检测，方法为三点弯曲实验， 测量股骨骨折时所承受的最大应力。仪器为 ElectroForce 3200 Series II Test Instrument，BOSE。

1.7 统计学方法

各组数据以均数 ± 标准差表示，使用 SPSS 22.0 软件进行处理，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用两样本 t 检验。P ﹤ 0.05 认为差异具有统计学意义 ， P ﹤ 0.01 认为差异具有显著性。

2.1 各组血浆 H2S 浓度的变化

和 Sham-GYY 组比较，OVX-vehicle 和 OVX-ALEN 血浆中硫化氢（H2S）含量均有下降或显著降低，而 OVX-

GYY 组血浆中硫化氢含量变化不明显。如图 1。通过腹腔注射 GYY 在第 2 周和第 4 周显著提高了的 OVX 大鼠血浆  H2S   浓  度 ，（13.47±3.64 vs. 5.00±1.33;11.28±1.95 vs.

5.08±2.36;所有 p<0.01，如图 1），随着时间推移，在第

8 周和第 12 周外源性 GYY 對大鼠血浆 H2S 浓度的提升影响仍显示有效（11.20±3.53 vs. 5.63±2.32;13.08±2.99 vs.

5.98±2.06;所以 p<0.05，如图 1）。

组 sham-GYY 比较; # 表示 p<0.05， 与实验对照组 OVX-

vehicle 比较;## 表示 p<0.01， 与实验对照组 OVX-vehicle 比较）

2.2 股骨组织的切片 H&E 在显微镜下观察

实验对照组在显微镜下可以观察到骨小梁结构的明显崩塌减少稀疏，这确认 OVX 骨质疏松造模的成功，而OVX-ALEN 和 OVX-GYY 组可以观察到大鼠股骨骨小梁的恢复，这个结果定性显示了补充外源性 H2S 和阿伦瞵酸钠均对骨质疏松病情的恢复和改善有治疗效果（如图 2）。

2.3 GYY4137 减缓去卵巢疏松和腰椎股骨骨密度减低于正常对照组比较，大鼠第 4、5 腰椎于去卵巢后

（OVX-vehicle）第 8 周及之后第 12 周均显示骨质密度减低

（0.195±0.007 vs. 0.244±0.023;0.193±0.017 vs. 0.239±0.013; 0.182±0.022 vs. 0.223±0.016;0.180±0.023 vs. 0.232±0.026;

所有 p<0.05;如图 3）;差异存在统计学意义。同时在第

12 周大鼠第 4 椎体样本结果显示 GYY4137 干预组 （OVX-

GYY） 反转了去卵巢导致的腰椎骨密度降低（0.190±0.040 vs. 0.182±0.022;p<0.05; 如图 3c）; 对骨质疏松的治疗效果甚至优于同组阿伦瞵酸钠干预组 （OVX-ALEN）。在大鼠双侧股骨骨密度测量实验中显示，第 12 周实验对照组 （OVX-vehicle） 相比正常对照组（sham-GYY）股骨密度降低（0.260±0.030 vs. 0.332±0.035;p<0.05; 如图 4b）， 通过阿伦瞵酸钠干预组 （OVX-ALEN） 和 GYY4137 干预组（OVX-GYY） 反转了实验对照组 （OVX-vehicle） 去卵巢导致的股骨密度减低（0.310±0.023 0.314±0.046 vs. 0.260±0.030;

p<0.05;如图 4b），数据结果显示阿伦瞵酸钠和 GYY4137 对骨质疏松治疗效果基本相同。

周测量图示。（* 表示 p<0.05， 与正常对照组 sham-GYY 比较;** 表示 p<0.01， 与正常对照组 sham-GYY 比较;

# 表示 p<0.05，与实验对照组 OVX-vehicle 比较;## 表示p<0.01，与实验对照组 OVX-vehicle 比较）

（* 表示 p<0.05，与正常对照组 sham-GYY 比较;** 表示

p<0.01，与正常对照组sham-GYY 比较; # 表示p<0.05，与实验对照组 OVX-vehicle 比较;## 表示 p<0.01，与实验对照组 OVX-vehicle 比较）

2.4 股骨骨折最大应力测试

股骨骨折最大应力测试，通过格拉布斯准则法（Grubbs） 剔除相关异常值，结果分析表明：在 12 周时实验对照组（OVX-vehicle） 大鼠股骨三点弯曲实验所承受的最大骨折应力数值有下降（121.59±26.56 vs. 157.79±14.83;p<0.05;如图 5b），OVX 骨质疏松模型改变了大鼠股骨的最大生物力学载荷，符合骨质疏松的发生。而通过阿拉丁和 GYY4137 干预的大鼠，最大负荷应力与正常对照组无明确统计学差别（p>0.05）; 而阿拉丁和GYY4137 干预組之间进行对比， 也无明显统计学差别（p>0.05;图 5ab）。

图 5 大鼠双侧股骨骨折最大应力数值：a 第八周大鼠双侧股骨样本骨折最大应力图示;b 第 12 周大鼠双侧股骨样本骨折最大应力图示。（* 表示 p<0.05，与正常对照组sham-GYY 比较;** 表示 p<0.01，与正常对照组 sham-GYY 比较; # 表示p<0.05，与实验对照组 OVX-vehicle 比较;## 表示 p<0.01，与实验对照组 OVX-vehicle 比较）

在我们的研究中，通过实验大鼠去卵巢来重现模拟了绝经后骨质疏松的病理过程，股骨 HE 染色的镜下微观骨小梁观察、大鼠腰椎及股骨骨密度、大鼠股骨最大骨折应

力数据均确切表明去卵巢大鼠骨质疏松这一经典实验模型的成立。通过腹腔注射外源性 H2S 供体 GYY 可以有效提高大鼠血浆的 H2S 浓度水平，改善反转了因雌激素缺乏导致的大鼠腰椎骨密度和股骨最大应力降低，多组实验数据显示阿伦瞵酸钠干预组 （OVX-ALEN） 和 GYY4137 干预组（OVX-GYY） 对比正常对照组大鼠无统计学意义上的差别， 在第 12 周大鼠第 4 腰椎骨密度数据显示 GYY 甚至优于阿伦瞵酸钠的干预治疗效果，大鼠股骨的镜下对比观察也证实了这一点，GYY 的干预下 OVX 大鼠股骨骨小梁的结构和数目和正常对照组及阿仑膦酸钠干预组无显著性差别。

骨代谢在分子层面的调节同时存在多种信号通路相互影响，其对骨形成和骨吸收起着重要的作用 [4]。其中骨形成发生蛋白（BMP）/Smads 通路及 Wnt/β- 连环蛋白

（catenin）通路主要影响骨形成，而骨保护素（OPG）/ 核因子 κ B受体活化因子配体（RANKL）/ 核因子 κ B受体活化因子（RANK）通路则主要影响骨吸收。有研究表明，骨髓间充质干细胞产生的H2S 可以调节成骨分化，H2S 减少缺乏可使钙离子通道的巯基化减少，影响细胞壁 Ca2

+ 通道的內流，进而下调 PKC/ERK 介导的 Wnt/β-catenin 信号通路调控的间充质干细胞向成骨细胞分化。H2S 还可通过影响 BMP/Smads 通路的重要转录因子核心结合蛋白（Cbfα1/ Runx2） 和 Osterix 相互作用， 促进骨细胞的增值和分化，以及进一步启动成骨细胞特异性因子（如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙蛋白）的表达，从而促进骨的形成

[6]。BMP/Smads 和 Wnt/β-catenin 信号通路存在相互调节作用 [7]，H2S 同样也在实验中观察到通过 MAPKs 途径中的

EPK1/2 和 p38 依赖的机制对抗氧化应激损伤，促进成骨细胞的分化和增殖，减轻炎症反应 [8]。这些报道和本实验的结果一致并相互验证，说明了 H2S 对骨代谢的有益作用， 具有潜在改善骨质结果的效果。

传统上硫化氢被认为是一种剧毒臭鸡蛋气味的有害物质，高浓度下的毒性作用主要由于其抑制线粒体中的细胞色素 C 氧化酶，对线粒体的抑制作用甚至强于氰化物，有报道 H2S 在人体中毒时血液硫离子浓度为 3-995μM[9]。生理浓度和最低中毒浓度较为接近，高剂量的 H2S 甚至可诱

导实验鼠脂多糖介导的炎症反应以及感染性休克患者血浆H2S 浓度同步增高 [10]。本动物实验以大鼠为研究对象，而实际上外源性 H2S 对人体的实验数据结果可能存在差异， 不同浓度的硫化氢、不同的给药方式、给药速度对骨质疏松的影响及其长期使用对心肝肾等重要脏器功能的影响有待进一步实验观察确认，总之，本研究创新性地对比观察了 GYY4137 和双膦酸盐类药物阿仑膦酸钠对去势大鼠骨质疏松症的实际治疗效果。结论表明外源性给予 GYY4137 来提高血浆 H2S 浓度有益大鼠骨质疏松症的治疗，这或许是另一个人类骨质疏松症的治疗的潜在靶点，对今后骨质疏松症的新药开发研究具有有益的提示作用。

639-650.

oxidative stress and its acceleration by loss of sex steroids. J Biol Chem. 2007;282（37）：27285–97