朱崇文 戴林建 等

摘  要：为了解高钾烤烟苗期根系在低钾胁迫下的差异表达蛋白及其作用机理，本研究分别提取低钾和正常钾营养液培育的高钾烤烟品系HKDN-5的苗期根系蛋白，酶解后采用液相色谱串联质谱和label-free蛋白定量技术对差异表达蛋白进行鉴定分析。结果表明，与正常钾相比，低钾组共发现681个差异表达蛋白，其中有359个发生下调表达，322个上调表达。差异表达蛋白主要参与脂质代谢、次生代谢、碳水化合物代谢和遗传信息加工等途径。其中，下调蛋白具有翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白相关功能的数量最多，上调蛋白主要为一般功能相关蛋白。差异倍数较大的蛋白主要与代谢和应激反应过程相关。以上结果表明，低钾胁迫产生的差异蛋白主要参与物质代谢及应激反应等相关过程。

关键词：高钾烤烟;苗期根系;低钾;label-free蛋白定量技术;差异蛋白质

中图分类号：S572.01          文章编号：1007-5119（2019）01-0058-09      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.008

Abstract： To understand the differential expression proteins and their functional mechanisms in root system of seeding stage high potassium flue-cured tobacco under low potassium stress， root proteins were extracted from seedling stage high potassium flue-cured tobacco variety HKDN-5 cultivated in low potassium and normal potassium nutrient solutions. After enzymolysis LC-MS and label-free protein quantification technique were used to identify and analyze the differential expression of proteins. The results showed that there were 681 differentially expressed proteins in the low potassium group compared with the normal potassium group， 359 proteins were down regulated and 322 proteins were up regulated. Differential expression proteins were mainly involved in lipid metabolism， secondary metabolites biosynthesis， carbohydrate metabolism and genetic information processing. The highest number of down regulated proteins was identified with the function of post translational modification， protein transformation， and chaperone related functions， the up regulated proteins were mainly the general functional related proteins. The proteins with large change folds were mainly related to metabolic and stress response processes. The above results indicated that the differential proteins produced by low potassium stress may participate in related processes such as substance metabolism and stress responses.

Keywords： high potassium flue-cured tobacco; root system of seedling stage; low potassium; label-free protein quantitative technique; differential protein

鉀是烤烟重要的品质元素，能显著改善烟叶的燃烧性和烟叶品质，降低烟叶焦油产生量，对提高烟叶可用性、烟草生长发育起重要作用[1]。根系是烟草吸收土壤中水分和养分以及合成激素、生物碱的重要器官，烟草根系发育的好坏，直接影响烟株的长相、长势，进而影响烟草的产量、质量及内在品质[2]。高钾烤烟品系是戴林建等[3]利用花粉管通道法将空心莲子草等高钾作物的DNA导入烟草品种K326，经过单株选择法和数年的比较鉴定而获得。该品系主要表现为农艺性状稳定，株高、节距、茎围等农艺性状和叶片中总氮、蛋白质、烟碱、钾含量等化学成分较普通烤烟优势明显[4]，钾含量也高于普通烤烟品种，缺点是抗病性较差[5]。

蛋白质组一词最早是由澳大利亚科学家WILKINS和WILLIAMS于1994年提出[6]。蛋白质为基因功能的体现者和执行者，探讨蛋白质的表达模式和功能模式，才能更好地认识生命活动的现象和本质[7]。JIN等[8]采用2-DE和毛细管液相色谱串联质谱的方法研究了烟草幼苗受到4 ℃低温伤害4 h以后叶片的蛋白质表达情况，处理叶片中下调表达的蛋白点有21个，上调表达的蛋白点8个。这些差异表达蛋白质主要与信号转导、蛋白质加工、光合作用、光呼吸、碳氮代谢和能量代谢相关。label-free是一种无标记定量蛋白质组学技术，一般分成两种方法：其一是基于谱图峰高、谱图峰面积和谱图峰容量等，为信号强度法;其二是基于肽段匹配的二级谱图数目，为谱图计数法[9]。理论上，label-free可应用于任何样本的蛋白质定量分析，可对不同来源的同一样本的定量数据进行互相比较，且数据移植性高[10]，适应范围广。弓青霞等[11]应用label-free蛋白定量技术研究牙囊细胞（hDFCs）和牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）差异表达蛋白质，发现当hDFCs分化成hPDLFs后，有22个差异表达蛋白，其中下调15个，上调7个，这些差异蛋白为研究hDFCs向hPDLFs的转化机制提供方向。

本研究以自主培育的高钾烤烟品系苗期根系为材料，采用label-free蛋白质组学技术结合液质联用技术，对低钾营养液和正常钾营养液分别培育的烟苗根系的蛋白表达进行比较研究，分析低钾胁迫下烟苗根系蛋白的差异表达，并初步探讨差异表达蛋白的作用机制，为烟草品种选育与栽培调控提供基础。

1  材料与方法

1.1  供试材料

高钾烤烟品系HKDN-5种子由湖南农业大学提供。

1.2  试验方法

1.2.1  材料种植  取试验烟草材料，播种于育苗盘中进行水培培养。试验材料分为两组，一组加低钾营养液实行低钾处理（K+浓度为0 mg/L），即把Hoagland's营养液中的硝酸钾和磷酸二氢钾用等量的硝酸钠和磷酸二氢钠代替;另一组加正常Hoagland's营养液作为对照处理（K+浓度为240 mg/L）。均在温度为25～30 ℃、光照充足等适宜条件下培养。

1.2.2  样品采集和蛋白质制备及浓度测定  待试验烟苗生长到5～6片真叶时，每组选取长势均匀的4～5株烟苗，取其根系制成混合样，每组设3个重复，迅速投入液氮罐中保存备用。

每组取适量根系样品在液氮中研磨至粉末。加入2 mL细胞裂解液[30% sucrose，0.5 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，20 mmol/L DTT，0.1 mol/L KCl，2% SDS，1% Protease Inhibitor Cocktail（100×）]，于冰上超声裂解1 h，低温离心（4000×g，4 ℃，30 min）。后加入等体积的Tris-HCl苯酚饱和溶液，4 ℃下震荡30 min使其混匀。混合液低温离心（4000×g，4 ℃，15 min），取其上层酚相。重复萃取1次，加入5倍体积的丙酮溶液混匀，于−20 ℃沉淀过夜。高速离心（16 000×g，4 ℃，15 min）沉淀蛋白质，弃上清，沉淀用丙酮溶液漂洗2次，每次漂洗后均要离心。真空干燥沉淀，保存于−20 ℃中待用。蛋白浓度的测定采用Bradford[12]法进行测试。

1.2.3  蛋白酶解  精准取出100 μg冻干样品转移至新试管中，用8 mol/L尿素调至100 μL定容。加入11 μL 1 mol/L DTT，在37 ℃下孵育1 h后，将样品加到10 kDa超滤管（Millipore，Billerica）中，14 000×g离心10 min，之后加入120 μL 55 mmol/L碘乙酰胺，室温下避光温育20 min。在超滤管中用100 mmol/L TEAB连续离心3次置换尿素体系后，加入Trypsin（Promega），蛋白∶酶=50∶1，酶解过夜，冻干。

1.2.4  nano-HPLC-MS/MS分析  将冻干后的肽段重溶于30 μL 0.1%甲酸水溶液中，后用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。实验在Nano ACQUITY UPLC系统（Waters Corporation， Milford， MA）上进行，系统连接装有在线nano电喷雾离子源的Q-Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）。Q-Exactive质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。在70 kDa质量分辨率下获得全扫描谱图（m/z 300～1800），随后在17.5 kDa分辨率下进行后续HCD MS/MS扫描，动态排除时间20 s。10 μL肽段样品以10 μL/min流量上样到捕集柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18， 100 μm×2 cm），随后在分析柱（Acclaim PepMap C18， 75 μm×15 cm）中以线性梯度分离：120 min内3% A至32% A（A： 0.1% 甲酸ACN溶液）。柱子在初始条件下平衡10 min，柱流量控制在300 nL/min，电喷雾电压2 kV。

1.2.5  数据分析  串联质谱图经过PEAKS Studio version 8.5（Bioinformatics Solutions Inc.， Waterloo， Canada） 分析。PEAKS DB对UniProt-Nicotiana数据库（ver.201711， 73606 entries）搜库，设置trypsin酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.05 Da;母离子质量容许误差：0.001‰;最大漏切数：2;固定修饰：Carbamidomethylation 57.02;可变修饰：Oxidation （M） 15.99;Deamidation（NQ）0.98;Acetylation （Protein N-term） 42.01。肽段经过1% FDR和1 unique peptide质控过滤。筛选差异倍数1.5倍以上，含有至少2条unique肽段，根据ANOVA算法取significance大于13（即p<0.05）的蛋白作为差异表达蛋白。并对蛋白进行GO（Gene Ontology）注释分析蛋白的分子功能、细胞中所处的位置以及参与的生物过程，COG&KOG注释分析进行蛋白功能预测、分类，取富集到该通路的p<0.05的Pathway代谢通路分析蛋白参与的生物过程。

2  结  果

2.1  不同钾浓度下烟草根系表型情况

由图1和表1可知，正常钾组虽然根系长度低

于低钾组，但是其须根数和主根直径皆多于或大于低钾组，且根鲜质量和干质量也大于低钾组，而低钾组的干鲜比高于正常钾组。说明正常钾浓度组的植株根系較低钾组发达，物质积累多，为烟株的生长发育提供基础;低钾组根系含水量太高，而干物质积累不足。

2.2  差异蛋白统计

统计低钾对比正常钾组差异倍数为1.5以上，且有显著性意义（p<0.05）的差异表达蛋白数量，具体在不同差异倍数下的差异表达蛋白数量统计于表2。由表2可知，低钾组相对于正常钾组差异表达蛋白总数为681个，其中下调的蛋白有359个，上调的有322个。上调和下调差异蛋白主要集中在[1.5， 2]差异倍数区间，分别占下调差异蛋白和上调差异蛋白总数的60.4%和43.5%，差异倍数≥8时，下调和上调蛋白均最少，只占2.2%和5%。1.5≤差异倍数<2和2≤差异倍数<4的上调差异蛋白数目差距不大，而在这两个区间下调差异蛋白数目差距较大。差异蛋白总数基本上在[1.5， 4]差异倍数区间，合计605个，占差异蛋白总数的88.8%。说明低钾胁迫主要引起蛋白下调表达，在本试验的钾浓度差异下，不会引起蛋白大量发生差异倍数较大的表达。

2.3  生物信息学分析

2.3.1  差异蛋白的GO注释  如表3所示，最多的差异表达蛋白定位在细胞组分、细胞器组分和有膜细胞器中，占差异蛋白总数的69%;大部分差异表达蛋白参与水解酶活性、离子结合和有机环与杂环化合物结合，占差异蛋白总数的74%;差异表达蛋白参与细胞代谢、有机物代谢、基本代谢、单体代谢、单体细胞过程和氮组分代谢过程的数量最多，占比为68%。说明低钾胁迫下的差异蛋白更多定位在细胞组分和有膜细胞器中，具有离子结合、有机环和杂环化合物结合等分子功能，参与细胞、有机物和基本代谢等生物过程。

2.3.2  差异蛋白的KOG注释  如图2所示，该图表示低钾组对比正常钾组具有不同功能的差异表达蛋白数量统计，功能蛋白可分为20类：A，RNA加工及修饰;B，染色体结构与动力学;C，能量产生和转换;E，氨基酸运输和代谢;F，核苷酸运输和代谢;G，碳水化合物运输和代谢;H，辅酶运输和代谢;I，脂质运输和代谢;J，翻译、核糖体结构和生物起源;K，转录过程;L，复制、重组和修复;M，细胞壁、细胞膜和包膜的生物起源;O，翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白;P，无机离子运输和代谢;Q，次生代谢产物生物合成运输和分解代谢;R，一般功能;S，未知功能;T，信号传导机制，U，胞内运输、分泌和膜泡运输;Z，细胞骨架等相关蛋白。差异表达蛋白中数量最多的为O类相关蛋白，数量最少的为B类蛋白和Z类蛋白。681个差异蛋白中，有532个具有KOG号，对这些具有不同功能的差异表达蛋白数量进行统计（表4），可知上调蛋白数量最多的为R类蛋白，数量最少的为B类蛋白和L类蛋白，下调蛋白数量最多的为O类蛋白，数量最少的为Z类蛋白。

2.3.3  差异蛋白的KEGG pathway分析  KEGG数据库可以确定蛋白质参与的最主要的信号转导通路和生化代谢通路，有助于了解基因或蛋白的生物

学功能。根据低钾对比正常钾组差异表达蛋白的KEGG pathway分析可知，这些蛋白共参与99条通路途径。包括40条代谢通路，24条合成途径通路等。差异蛋白质参与具有显著性差异（p<0.05）的通路途径有：果糖和甘露糖代谢、苯丙素生物合成、蛋白酶体和核苷酸切除修复等与物质代谢和遗传信息处理相关途径，说明低钾胁迫下的苗期根系蛋白主要参与物质代谢和遗传信息处理相关过程。

3  讨  论

钾离子是一种矿质离子，它的缺失必然打破离子平衡，影响胞内物质的运输。低钾胁迫能够影响金属矿质离子的运输、水通道蛋白的活性、ATP的跨膜运输、氨基酸蛋白质的运输、硝酸盐的运输等[13]。在本试验中，由于钾离子的缺失，造成了诸多与代谢相关转运蛋白的上调表达，其中包括3个质膜上H+转运ATP酶、1个Ca2+转运ATP酶、2个磷酸盐运输相关蛋白、1个氯离子通道相关蛋白等。此外，有1个K+转运蛋白上调也较为明显。离子ATP酶可利用水解ATP所释放的能量逆化学和电梯度驱动离子跨质膜运输，通道蛋白可促进水分和离子顺能量梯度扩散[14]。低钾胁迫中，逆境信号的传导是通过信号系统完成的，活跃的信号传导系统通常表现为钙离子运输活性增加，调整信号通路过程。然后经下游功能基因表达在促进和调控烟草新陈代谢过程中行使功能，以便对烟草自身进行调整来应对低钾逆境[13]。这便解释了试验结果中差异倍数较大的差异蛋白以参与无机离子运输和代谢相关过程为主，且全为上调表达的原因。

研究表明，烟草幼苗在缺钾处理后，产生的差异蛋白主要具有新陈代谢、细胞过程和应激反应相关功能[15]。苎麻在经过短时间低钾处理后，差异蛋白更多具有能量代谢和光合作用等相关功能[16]。棉花幼苗应答低钾胁迫的蛋白质同样主要具有能量代谢和胁迫防御相关功能，主要参与植物代谢、胁迫应答及氧化胁迫等生物学过程[17]。植物在缺钾条件下产生的差异蛋白点不仅与钾运输体有关，而且与代谢密切相关，低钾条件下诱导表达的蛋白，很多属于物质和能量代谢蛋白[18]。

本文研究结果中，低钾胁迫下产生的差异蛋白主要参与细胞、有机物等相关代谢过程，具有代谢、细胞过程和环境信息处理等应激反应相关功能。这与前人研究结果大部分相同，表示与物质代谢和应激反应相关的蛋白能在大部分植物的低钾胁迫中发生作用，对植物体正常生长发育提供保障。

有研究证明烟草[15]、苎麻[16]和棉花[17]等在低钾胁迫下产生的差异蛋白中与代谢过程相关的主要包括氨基酸氨基转移酶、ATP合成酶、已糖激酶、磷酸酶类等。而在本试验鉴定的与代谢相关且差异明显的蛋白中，除了有ATP酶和磷酸酶类外，还主要包括丝氨酸羧肽酶、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶、UDP-糖基转移酶、液泡转化酶等，其中只有液泡轉化酶发生下调表达。产生差异的原因可能与低钾处理时间、植物组织差异或烤烟高钾品系的特殊性相关。

丝氨酸羧肽酶是一类α/β水解酶家族的蛋白酶，在植物许多生化途径、生长发育及抵抗逆境方面发挥重要作用[19]。δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶可以提高植株脯氨酸的含量，起到抗旱、耐盐的作用，是植物通过谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶[20]。UDP-糖基转移酶的上调表达催化了糖基转移反应，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子上，从而调节受体分子在细胞和机体内的活性，在调节植物体内激素平衡、解除外源毒素毒性以及次生代谢产物的合成、贮存等方面发挥重要功能[21]。液泡转化酶通过平衡蔗糖浓度调节细胞的渗透势和糖信号，与库结构的膨大生长密切相关[22]，抑制还原糖的产生，为植物代谢途径提供能量。故此，该酶发生下调表达，这与烟草液泡转化酶抑制子的作用相符[23]。这些酶在高钾烤烟根系物质代谢相关过程发挥重要的作用。

研究发现烟草[15]、苎麻[16]和棉花[17]等植物在低钾胁迫下的差异蛋白中与应激反应相关的主要包括超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、转录因子等。而在本研究鉴定中，主要为磷脂酰肌醇磷脂酶、尿苷激酶等酶发生上调表达、木质部半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶等发生下调表达。鉴定的差异蛋白存在不同，可能与钾处理的时间不同或烤烟高钾根系的特殊性相关，能为烤烟高钾品系的差异蛋白质组学提供研究基础。

磷脂酰肌醇磷脂酶在植物中信号传导途径有着很大作用，能够参与调控防御反应和渗透调节等方面[24]。尿苷激酶能够催化尿苷磷酸化，是嘧啶核苷酸补救合成途径中的关键酶[25]，在植物体核苷酸代谢发挥作用。木质部半胱氨酸蛋白酶是植物管状细胞凋亡过程中的自溶酶，参与植物与多种病原物互作[26]。同时，半胱氨酸蛋白酶也参与种子萌发、幼苗发育、组织分化、衰老、细胞程序性死亡和各种胁迫应答等生物学过程[27]，该酶与天冬氨酰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶都参与蛋白水解机制[28]。在逆境环境下，不利于蛋白合成和生长发育的蛋白下调表达，符合维持内环境稳定的要求。

试验鉴定结果中还发现几丁质酶、咖啡酸-O-甲基转移酶和2-烯醛还原酶等酶发生上调表达，其在烟草根系生长发育过程的作用也不容忽视。

几丁质酶是植物重要的防卫因子，在植物生长发育、抗逆和防御反应中发挥重要作用[29]。苯丙素生物合成途径是植物生长发育过程中重要的途径之一，该途径会产生重要的生理代谢产物，在植物发育、机械支持和抗病等方面发挥着重要作用[30]，咖啡酸-O-甲基转移酶作为该途径的关键酶，在植物抗逆过程中发挥重要的作用[31]。研究证明，醛能够参与植物逆境下的毒害作用以限制植物生长，而2-烯醛还原酶能够有效的清除醛[32]，有助于植物生长发育。

此外，还有抗病相关蛋白、囊泡复合物亚基、转运相关蛋白都发生上调表达，无疑在机体抗病方面、物质运输和转运等方面发挥重要作用，保证植物体正常生长发育。

4  结  论

本研究通过label-free定量蛋白质组学技术对低钾胁迫下高钾烤烟品系HKDN-5苗期根系差异表达蛋白进行分析鉴定，发现大部分差异表达蛋白定位在细胞组分、细胞器组分和有膜细胞器中，具有水解酶活性、离子结合、有机环与杂环化合物结合等分子功能，参与细胞、有机物、单体和氮组分等相关代谢过程。差异表达蛋白在低钾胁迫中具有翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白相关功能的数目最多，且主要参与物质和能量代谢以及遗传信息加工和生物合成等通路途径，在烟草根系代谢和逆境应激反应过程发挥关键性作用。本文初步探讨了低钾胁迫下烟草根系的应答机理，但未对所得到的差异蛋白在应答机制中的具体作用进行详细阐述，差异蛋白在烟草钾积累、根系生长发育中的相关作用尚需深入探究。

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