宋晓培 宋文静 芦伟龙 等

摘  要：为研究不同硫酸钾用量对植烟土壤微生物的影响，采用连续8年田间定位试验分析了土壤细菌群落多样性。对各处理植烟土壤16S rRNA V3～V4区进行高通量测序，得到各处理植烟土壤细菌群落的α多样性指数、群落种类组成及丰度信息，并对群落组成及丰度进行了PCA聚类分析及UPGMA聚类分析，将排名前十优势细菌门与土壤pH、土壤酶活性、钾和硫含量进行相关性分析。结果表明：（1）与空闲地相比，不施肥连年栽烟土壤细菌数量降低;而施肥处理中，K2O的投入量为247.57 kg/hm2，S的投入量为125.46 kg/hm2时，细菌群落丰度、多样性和均匀度明显增加。（2）不同处理的土壤中变形菌门、酸杆菌门和放线菌门均为优势菌群，随着硫酸钾施用量的增多，酸杆菌门相对含量明显减少，而变形菌门与放线菌门均呈不同程度增加趋势。（3）细菌群落相似性分析结果表明，长期施用硫酸钾能显著改变土壤群落组成。（4）相关性分析表明，土壤pH、土壤蔗糖酶、脲酶活性、钾和硫含量对于该地区土壤细菌群落的丰度、多样性及优势种群相对丰度起着重要作用。

关键词：硫酸钾;烤烟;土壤;细菌群落多样性

中圖分类号：S572.01          文章编号：1007-5119（2019）01-0033-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.005

Abstract： To study the effects of different potassium sulfate dosages on the bacterial community diversity of tobacco planting soils， soil bacterial community diversity was analyzed by consecutive field experiment for 8 years. High-throughput sequencing of the 16S rRNA V3-V4 region of each treated tobacco planting soil was carried out， and α diversity index， community species composition and abundance information of the bacterial communities were obtained. The community composition and abundance were analyzed by PCA cluster analysis and UPGMA cluster analysis. The correlations between the top ten dominant bacteria and soil pH， soil enzyme activity， potassium and sulfur content were analyzed. The results showed that： （1） Compared with the natural vegetation， the amount of bacteria of CK was reduced. In the fertilization treatments， the abundance， diversity and uniformity of the bacterial community increased significantly when the input of K2O was 247.57 kg/ha， and the input of S was 125.4 kg/ha. （2） Proteobacteria， Acidobacteria and Actinobacteria were the dominant bacteria in all treated planting soils of this experiment， and with the increase of potassium sulfate application， the relative content of the Acidobacteria was significantly reduced， while Proteobacteria and Actinobacteria increased in different degrees. （3） The results of bacterial community similarity analysis for each treatment showed that long-term application of potassium sulfate could significantly change the soil bacterial community composition. （4） Correlation analysis showed that soil pH， soil sucrase activity and urease activities， the content of potassium and sulfur played an important role in the abundance， diversity and relative abundance of soil bacterial communities in the region.

Keywords： potassium sulfate; flue-cured tobacco; soil; bacterial community diversity

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，时刻进行着活跃的新陈代谢，在土壤有机质分解、物质转化与能量传递等方面有着重要的作用[1-2]。土壤微生物群落对环境变化十分敏感，能通过对土壤微生物群落结构分析反映土壤质量的变化。细菌作为土壤微生物重要的组成部分，对土壤养分的形成与分解有促进作用[3-4]。已有大量研究证明，耕作方式与施肥措施对土壤微生物数量及活性有重要影响，能显著提高土壤微生物的数量与活性[5]，从而有利于土壤质量的维护[6]。靳振江等[7]研究表明添加有机质对微生物丰度提高具有决定性的作用，因为土壤有机碳与土壤养分不但为微生物提供了丰富的可利用底物，而且发达的根系通过其穿插作用，改善了土壤结构，为微生物的生存提供了良好的外部环境。王慧颖等[8]、周晶等[9]研究表明，与不施化肥相比，施用化肥会显著降低土壤微生物的数量，这可能是由于长期施用化肥引起土壤pH下降，而土壤细菌群落与pH密切相关。

施肥可以改善根际土壤养分有效性和根际微生物区系，从而提高作物产量和质量[10]。硫酸钾是烟草生产上最主要的钾肥，施入土壤中使得烟叶和土壤中的钾含量均提高的同時，硫含量也相应地提高[11]，但土壤微生物群落结构变化特征未深入研究。本研究以16S rRNA基因V3-V4区为分子标靶，采用高通量测序技术，分析不同硫酸钾用量下植烟土壤细菌群落组成及多样性变化，以了解细菌群落结构随硫酸钾施用量的变化情况。

1  材料与方法

1.1  试验地概况

田间定位试验始于2010年在中国农业科学院青岛烟草资源与环境野外科学观测试验站进行，北纬36°26'54″，东经120°34'38″，海拔 75 m。土壤类型为棕壤，2010年土壤测试结果为：pH 5.56，有机质11.66 g/kg，碱解氮52.69 mg/kg，有效磷10.60 mg/kg，速效钾105.25 mg/kg。

1.2  试验设计

试验设置5个处理：NV（休闲地）;CK（不施肥，连年栽烟）;T1处理施用硫酸钾型复合肥（N、P2O5、K2O和S的质量分数分别为15%、15%、15%和12%）550.5 kg/hm2;T2处理在处理T1基础上增施硫酸钾（含K2O和S分别为50%和18%）165 kg/hm2;T3处理在T1基础上增施硫酸钾330 kg/hm2。各试验处理的养分施用量见表1。

每个处理3次重复，随机区组排列。小区长5 m，宽4.4 m，行距1.1 m，株距0.5 m，栽烟40株。供试烤烟品种为NC89，每年6月上旬移栽，肥料于起垄时一次性条施。2017年8月29日烤烟成熟期，采用五点取样法，在每个小区采集0～20 cm土壤，混匀后进行土壤细菌群落的测定与分析，测定土壤蔗糖酶、土壤脲酶和土壤酸性磷酸酶活性，同时将土壤样品风干研磨过2 mm筛及0.15 mm筛后测定pH及钾和硫含量。

1.3  方法

1.3.1  土壤pH、土壤酶活性以及钾和硫含量的测定  土壤pH采用电位法[m水∶m土=2.5∶1];蔗糖酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法，土壤脲酶活性用靛酚蓝比色法，土壤酸性磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法;有效硫采用磷酸盐浸提-硫酸钡比浊法;全硫采用酸消化-硫酸钡比浊法测定;速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法;全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法。

1.3.2  土壤微生物基因组DNA的提取  使用E.Z.N.A.TM（Omega Bio-Tek，USA）试剂盒提取土壤微生物基因组DNA（gDNA）。然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

1.3.3  土壤细菌16S rRNA PCR扩增  PCR采用

TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，每个样品3次重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测。引物序列：338F（ACTCCTACGGGAGG CAGCAG）;806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR反应体系见表2。

参照电泳初步定量结果，PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。检测合格的文库采用Illumina miseq对16S rRNA基因序列的V3-V4区进行高通量测序。

1.4  数据处理

利用软件QIIME在97%相似度下聚类OTU和分析Alpha多样性指数（Chao1、Shannon、goods_coverage、observed_species），并进一步分析稀释曲线，利用R语言工具制作曲线图;同时基于每个样品OTU的组成，利用R语言进行PCA、Venn统计分析和作图;采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析，所选择的数据库为Silva、RDP及Greengene，数据库主要包含16S细菌核糖体数据库;使用统计学分析方法及R语言作柱状图分析细菌群落结构;基于Unweighted Unifrac距离矩阵，UPGMA方法聚类建树，并将聚类结果与各样品在门、纲、目、科、属水平上的物种相对丰度整合展示。

其余试验数据采用Excel及SAS 9.2统计软件进行数据统计与分析，处理间差异采用Duncan多重比较方法，差异显著性水平为0.05。

2  结  果

2.1  不同处理土壤细菌α多样性分析

各处理植烟土壤样品测得16S rRNA V3～V4区原始序列数、质控序列数、有效序列数、α多样性指数统计见表3。覆盖率指数为0.97～0.98，说明制备的MiSeq文库覆盖了土壤样品中97%～98%的细菌类群，库容足够大，能够反映土壤样品中细菌的真实组成。OTUs丰度稀释性曲线（图1）表明随着读数量的增加，曲线逐渐趋于平坦，说明测序数据量合理，通过PCR扩增出的序列数可以反映各处理土壤中的细菌群落组成。

α多样性可以反映微生物群落的丰度和多样性，α多样性越高，细菌种类越丰富，群落越稳定。

Shannon指数评价物种群落组成的均匀度，observed_species和Chao1指数反映群落物种丰富度。各处理shannon指数为8.32～8.82，大小依次为CK<NV<T1<T2<T3;observed_species指数为       1 604.06～1 789.74，大小依次为T1<T2<CK<NV <T3;Chao1指数为2 102.14～2 305.43，大小依次为T2<T1<NV<CK<T3。与NV、CK处理相比，处理T1、T2、T3的shannon指数均有一定程度提高，表明长期施肥能在一定程度上提高土壤细菌群落的多样性;observed_species及chao1指数均有所下降，而处理T3上升，说明处理T1、T2土壤细菌数量降低，处理T3的土壤细菌数增多。总体来说，土壤中K2O的投入量为247.57 kg/hm2，S的投入量为125.46 kg/hm2时，土壤细菌的数量及多样性均有所提高。

2.2  细菌OTUs分布

Venn图能够直观的反映出不同土壤样品中共有OTU以及差异OTU，进而通过OTU信息来探索不同处理下细菌的响应状况。从图2中可以看出，各处理土壤样品一共有3626个细菌OTU，共有的OTU为1860个，每个处理的土壤样品中均有数量不等的其他样品没有出现的OTU。NV特有菌种为67个，CK特有菌种为45个，T1特有菌种为6个，T2特有菌种有20个，T3特有菌种为60个，说明长期施肥改变了原有细菌群落，对烟田土壤中细菌群落结构产生了一定程度的影响。施肥的处理中，随着硫酸钾施用量的增多，特有菌种数逐渐提高，即不同硫酸钾用量对土壤细菌群落结构的影响不一致。

2.3  细菌群落种类组成及丰度

对不同样品中优势细菌门的分析表明（图3），不同硫酸钾施用量植烟土壤相对丰度排名前十的

细菌门分别是变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）。这些细菌门类的相对比例占各样品总序列数的94.94%～96.48%。不同硫酸钾用量处理细菌群落组成整体变化不大，但不同门的细菌数量均有变化，比如，T3处理变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门所占比例明显升高，而酸杆菌门、绿弯菌门所占比例减少。

2.4  细菌群落相似性分析

PCA分析结果表明（图4），第一主成分可以解释23.21%的微生物组成成分，第二主成分可以解释18.87%的微生物组成成分。总体来说，NV在PC1的负半轴，而其他处理在PC1的正半轴，说明CK、T1、T2和T3处理中微生物群落结构均发生了一定程度的改变;而CK、T1均分布在PC2的负半轴，T2横跨PC2的正负半轴，T3分布在PC2的正半轴，说明在施用钾肥的3个处理中，T3处理发生显著变化，表明此处理钾肥用量在一定程度上改变了土壤微生物群落结构。UPGMA聚类分析表明（图5），除个别样品外，主要分为两大类，即施肥处理（T1、T2、T3）与不施肥处理（NV、CK），说明施用化肥后各菌群丰度发生了明显变化;T1、T2处理被聚为1个分支，T3处理单独一个分支，说明T1与T2处理菌群丰度相似性较T3处理更高。说明不同

硫酸钾用量对植烟土壤微生物群落结构产生不同影响。与PCA聚类分析结果相一致，当K2O的投入量为247.57 kg/hm2，S的投入量为125.46 kg/hm2时，对土壤微生物群落结构的影响最大。

2.5  土壤pH、土壤酶活性、钾和硫含量与优势菌门相对丰度的相关关系

对不同处理土壤pH、土壤酶活性、钾和硫的含量进行分析，结果表明（表4），与休闲地相比，不施肥、连年栽烟及施用化肥均能显著降低土壤pH，且施用化肥的处理中，随着硫酸钾施用量增多，pH下降幅度增大。由表4可知，肥料的施入均在不同程度上提高了土壤蔗糖酶、脲酶以及酸性磷酸酶的活性、土壤有效硫、全硫、速效钾及全钾的含量，且不同硫酸钾用量作用不一致，T3处理即K2O的投入量为247.57 kg/hm2，S的投入量为125.46 kg/hm2时，提高作用更为显著。

将土壤pH、土壤酶活性、鉀和硫含量与前十优势菌门进行了相关分析（表5），结果表明排名前三的优势菌门即变形菌门、酸杆菌门以及放线菌门与pH、土壤蔗糖酶活性、脲酶活性、钾和硫的含量均存在显著或者极显著正（负）相关关系，初步推测硫酸钾的施入引起土壤群落结构的改变，可能是通过影响主要门类，改变了细菌群落之间的竞争关系，从而引起土壤微生物的改变。土壤pH还与芽单胞菌门、厚壁菌门及拟杆菌门存在极显著或显著显著负相关关系，与疣微菌门存在显著正相关关系。蔗糖酶活性还与芽单胞菌门、厚壁菌门及拟杆菌门存在极显著或显著正相关关系。脲酶活性还与疣微菌门呈显著负相关关系。有效硫还与芽单胞菌门及厚壁菌门存在显著正相关关系，与疣微菌门存在显著负相关关系。全硫还与疣微菌门存在显著负相关关系，与厚壁菌门存在正相关关系。速效钾还与绿弯菌门存在显著负相关关系，与芽单胞菌门、厚壁菌门及拟杆菌门存在极显著或显著正相关关系。全钾还与芽单胞菌门、厚壁菌门及拟杆菌门存在极显著或显著正相关关系。此外，土壤磷酸酶活性与任何优势细菌门均无显著相关性。

综合分析，该研究中土壤细菌群落组成与土壤pH、土壤蔗糖酶脲酶活性、土壤中钾和硫含量密切相关，而且硫酸钾的施用可能通过影响主要优势菌门进而影响土壤细菌群落组成。

3  讨  论

研究结果表明，与休闲地相比，不施肥连年栽烟处理α多样性指数、特有菌种数均有少许下降，即细菌群落的数量及多样性均有所降低，这可能是因为单一作物多年连续种植导致植物根系分泌物及植株残体随种植年限逐年累积，造成土壤微生物区系紊乱，这与郭丽丽等[12]，纳小凡等[13]，李倩等[14]研究结果一致。而施肥的处理中，T1、T2处理土壤细菌数量降低，但多样性有所增加，这可能是因为硫酸钾肥的输入相对较少，影响了对这些养分需求量较大的细菌的代谢活动，从而抑制其生长;T3处理的α多样性指数均有所增加，即K2O的投入量为247.57 kg/hm2，S的投入量为125.46 kg/hm2时，土壤中养分的输入达到相对均衡状态，能为各类细菌的生长和代谢提供能量，使得细菌的均匀度与多样性指数均提高。

研究表明，酸杆菌门在自然界中的各种环境中都广泛存在，有丰富的遗传多样性和代谢多样性[15]，具有降解植物残体多聚物、参与单碳化合物代谢等功能[16]，对生态的稳定性有很大的贡献。大多数的硫氧化菌属于变形菌门[17]。放线菌门大部分是腐生菌，在土壤中主要分解动物及植物有机残体[18]。对不同处理中优势细菌门的分析表明，不同硫酸钾用量植烟土壤细菌优势菌群结构组成变化较小，且随着硫酸钾施用量的增多，酸杆菌门呈下降趋势，变形菌门、放线菌门呈增加趋势。

土壤的全硫和全钾含量可以反映出土壤的供硫和供钾潜力，有效硫与速效钾是植物可以直接吸收利用的硫和钾形态，反映出土壤的供硫和供钾水平。硫酸钾肥的施入增加了土壤供钾供硫的潜力及水平，且硫酸钾施用量越多，增加作用越明显。这与张继光等[11]研究结果相一致。已有研究表明，土壤类型、土壤理化特征、环境因子以及植物类型均能在不同程度上影响土壤微生物的群落结构[19-20]。其中，土壤pH被认为是预测土壤微生物群落演替规律的最佳因子之一，并显著影响土壤细菌群落多样性[14，20-21]。酸杆菌门是嗜酸菌，酸性活动有利于其代谢活动，其主要功能是降解植物残体[12，15]。在本研究中，随着硫酸钾施用量的增多，土壤pH呈下降趋势，而酸杆菌门与土壤pH呈极显著正相关关系，即随着土壤pH的降低，酸杆菌门的相对丰度呈降低趋势，这与丁新景等[4]研究结果不一致，而与赵牧秋等[22]研究结果一致，说明酸杆菌门的分布除受pH影响外，还受到其他土壤因子的影响。相对丰度分析可知，变形菌门、酸杆菌门、放线菌门在各处理中的相对丰度分别为22.91%～40.76%、14.91%～39.78%、10.14～20.44%，是相对丰度排名前三的优势细菌门。土壤酶是具有加速土壤生化反应速率功能的蛋白质，酶的活性可以反映土壤養分（氮、磷、碳等）转化能力和土壤微生物活性[8，21]。土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶为土壤中与碳、氮、磷养分循环相关的主要酶类。相关性分析表明，蔗糖酶、脲酶活性对各处理细菌群落优势种群相对丰度起着重要作用。

4  结  论

研究表明，K2O的投入量为247.57 kg/hm2，S的投入量为125.46 kg/hm2时，细菌群落丰度、多样性和均匀度明显增加。对各处理进行细菌群落相似性分析，发现长期施用硫酸钾肥能明显改变土壤群落结构，而且硫酸钾用量与土壤细菌群落密切相关。

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