汪 群，闫 鹤

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510641）

腹泻是仔猪最常发的疾病之一，由于其高发病率与高死亡率，对养猪业造成了巨大的经济损失[1]。引发仔猪腹泻的病原有多种，其中大肠杆菌，特别是产肠毒素性大肠杆菌（ETEC），是仔猪腹泻的重要病原之一[2]。另外，肠道微生物失衡也是导致仔猪腹泻的一个重要因素[3]。腹泻发生时，病原微生物的定植急剧增加，仔猪肠道菌群结构遭到破坏，导致肠道微生态失衡[4]。分析腹泻仔猪与健康仔猪的肠道微生物差异，有助于早期诊断和预防腹泻。

哺乳仔猪肠道环境和免疫系统还不稳定和成熟，对病原微生物特别敏感，因此很容易受到感染而发生腹泻。目前对仔猪肠道菌群的研究主要集中在对不同年龄的纵向比较或断奶前后的饮食变化[5-7]，而对腹泻与健康仔猪肠道菌群的差异的报道较少。Hermann-Bank 等[3]研究表明，与健康仔猪相比，新生腹泻仔猪肠道放线菌门和厚壁菌门的相对丰度减少，而肠球菌和大肠杆菌的相对丰度增加。

随着测序技术的发展，采用16S rRNA 高通量测序的方法研究肠道菌群已成为热点。本研究通过对16 头腹泻和健康哺乳仔猪的粪便样本进行16S rRNA 测序，比较腹泻与健康哺乳仔猪的粪便菌群的结构差异，探究与仔猪腹泻相关的微生物病原，为腹泻仔猪的治疗提供依据和预防策略。

1 材料与方法

1.1 样品采集 从广东某规模化养殖场中采集15 日龄健康和腹泻仔猪粪便样品各8 份。腹泻仔猪表现为水样腹泻，粪稀，呈灰黄色，利用灭菌医用棉签蘸取肛门处粪便样品。健康仔猪同样采用灭菌医用棉签收集2～3 粒粪便样品。所有样品经干冰运输至实验室，-80℃保存。

1.2 样品总DNA 提取 所有粪便样品均采用QIAamp stool DNA Mini kit（Qiagen,U.S.）提取样品总DNA，具体操作严格按说明书进行。利用NanoDrop 2000 检测DNA 浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。DNA 于-20℃保存备用。

1.3 16S rRNA 基因扩增 选择16S rRNA 基因的V3-V4 区作为扩增和测序的目的区间。引物序列：338F：5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'；806R：5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3´。反应体系：4 μL 5× FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL Forward Primer（5.0 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5.0 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，10 ng DNA 模板，补足去离子水至20 μL。PCR 仪为ABI GeneAmp®9700 型，扩增程序：95℃预变性3 min，27 个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。

1.4 Illumina Miseq 测 序 使 用AxyPrep DNA 凝 胶 回收试剂盒（Axygen 公司）回收PCR 产物，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测，再用QuantiFluor™-ST（Promega，USA）检测定量。将PCR 产物经Illumina MiSeq 平台（Illumina，USA）进行测序，根据标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300 文库（上海美吉）。

1.5 统计分析 原始测序序列使用Trimmomatic 和FLASH软件进行过滤和拼接。使用UPARSE 软件，根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类。利用UCHIME 软件剔除嵌合体，采用RDP classifier 贝叶斯算法（置信度阈值为0.7）对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，并在界、门、纲、目、科、属、种7 个水平上统计每个样品的群落组成。选择Silva（Release 123 http://www.arb-silva.de）作为参考基因组数据库。使用Mothur 软件计算样本alpha 多样性指数，采用Sobs、Ace、Chao、Simpson、Shannon 和Coverage 评估指数分别对样本进行alpha 多样性分析。基于Bray-Curtis 算法计算样本间距离，并根据该距离对样本进行主坐标分析（PCoA）。物种差异分析采用Wilcoxon 秩和检验方法，确定2 组粪便菌群中具有显著性差异的物种。

2 结 果

2.1 测序数据整体分析 16 份粪便样本经测序后共得到858 444 条有效序列数，序列平均长度为454.14 bp，最小样本序列数为31 379 bp。对OTU 原始序列按最小样本序列数进行抽平，后续的所有分析均以抽平后的序列为基础进行聚类分析。通过同源性序列比对及聚类相结合的方法，所有序列共有20 个门、38 个纲、65 个目、121 个科、271 个属和694 个OTU。

2 组样本群落覆盖度超过99%，表明所有样本的测序深度足够，可以反映样本的微生物信息。表1 中Shannon 和Simpson 指数表明健康组仔猪粪便菌群的多样性高于腹泻组（P＜0.05）。Sobs、Ace 和Chao 指数表明健康组仔猪粪便菌群的丰富度高于腹泻组，但2 组间差异不显著。

表1 两组样本alpha 多样性

PCoA 分析用于比较腹泻和健康仔猪两组的群落结构。主坐标成分（PC1、PC2 和PC3）占有86.34% 的样本组成差异，表明健康和腹泻状态下样本的微生物群落组成是可以相互区分的，且仔猪腹泻后粪便菌群结构发生明显改变（图1）。

图1 Beta 多样性分析（OTU 水平的粪便菌群PCoA 分析）

2.2 粪便菌群组成结构分析 在门的分类水平上，腹泻组仔猪粪便菌群的分类数为16 个，其中变形菌门（Proteobacteria，53.62%）和厚壁菌门（Firmicutes，44.26%）是优势菌，约占总细菌的98%。健康组仔猪粪便中共有13 个菌门，其中厚壁菌门（56.24%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，26.92%）和变形菌门（9.42%）是优势菌（图2-A）。

在属的分类水平上，腹泻组和健康组仔猪粪便菌群的分类数分别是483 个和453 个，其中2 组共有的菌属是242 个，占总菌属的34.87%。腹泻组仔猪粪便中相对丰度较高的细菌依次是埃希氏- 志贺菌 属（Escherichia-Shigella，44.49%）、 乳 杆 菌 属（Lactobacillus，37.32%）、布鲁氏菌科未分类的属（unclassified_Brucellaceae，3.77%）和克雷伯氏菌属（Klebsiella，3.59%）（图2-B）。健康组中相对丰度较高的菌属则依次为拟杆菌属（Bacteroides，13.39%）、Lachnoclostridium（9.82%）、瘤胃球菌属（Ruminococcus，5.66%）、埃希氏-志贺菌属（5.15%）、梭菌属（Clostridium，4.51%）和乳杆菌属（3.73%）等（图2-B）。

图2 2 组样本在门水平（A）和属水平（B）上的粪便菌群组成结构

2.3 粪便菌群物种差异分析 在门的分类水平上，腹泻组与健康组之间有明显差异的菌门有4 种。与健康组比较，腹泻仔猪粪便中变形菌门的相对丰度显著增加，拟杆菌门的相对丰度显著降低（图3-A）。在属的分类水平上，在排名前15 的菌属中，腹泻组与健康组仔猪之间有明显差异的菌属有13 种。相较于健康仔猪，腹泻组仔猪相对丰度明显升高的菌属依次是埃希氏-志贺菌属、乳杆菌属、克雷伯氏菌属和布鲁氏菌科未分类的属，明显降低的是拟杆菌属、Lachnoclostridium 和瘤胃球菌属等（图3-B）。

图3 2 组样本在门水平（A）和属水平（B）上的物种差异分析

3 讨 论

动物肠道内有大量微生物，相对稳定的肠道菌群使肠道具有抵抗病原微生物入侵的作用[8]。本研究采用16S rRNA 高通量测序的方法全面评估哺乳仔猪粪便菌群，发现腹泻仔猪粪便菌群多样性低于健康仔猪。Hermann-Bank 等[3]发现腹泻仔猪菌群多样性低于健康仔猪。类似的，Pop 等[9]研究发现，腹泻儿童的粪便菌群多样性低于健康儿童。本研究发现腹泻仔猪粪便菌群多样性较健康仔猪显著减少，推测腹泻可能是仔猪粪便菌群失衡的重要因素。

本试验中，健康仔猪粪便菌群中的优势菌主要是厚壁菌门（56.24%）、拟杆菌门（26.92%）和变形菌门（9.42%），与Chen 等[10]研究一致，即厚壁菌门和拟杆菌门是健康哺乳仔猪肠道中丰度最高的菌门。仔猪腹泻后，其粪便菌群中变形菌门的相对丰度显著增加，而拟杆菌门显著减少。变形菌门包括很多病原体，如埃希氏菌属、沙门氏菌属和螺杆菌属。有研究表明，致病性大肠杆菌是仔猪腹泻的重要病原菌，其中ETEC 能黏附并产生肠毒素作用于小肠上皮细胞，导致水和电解质分泌过多，重吸收减少而导致腹泻[11]。本研究中，腹泻仔猪主要是埃希氏-志贺菌属的相对丰度显著增加，是健康组仔猪的9 倍，表明埃希氏-志贺菌属可能是本次仔猪腹泻发生的潜在致病菌，为下一步研究与腹泻相关的菌群及微生物学机制提供一定的基础。另外，拟杆菌属、Lachnoclostridium 和瘤胃球菌属主要参与碳水化合物等营养物质的代谢以及维持肠道正常的生理功能，这些有益菌数量在腹泻仔猪粪便中的相对丰度显著减少，使肠道对碳水化合物的消化吸收和代谢能力减弱，可能与腹泻发生相关[12]。

厚壁菌门是所有被检测仔猪粪便中的优势菌，可产短链脂肪酸和调节系统免疫反应。乳杆菌属于厚壁菌门，具有维持肠道正常菌群、抑制病原体粘附小肠壁和防止炎症发生等作用，然而具体的作用机制目前还不清楚[13]。本研究发现，乳杆菌属在腹泻仔猪中的相对丰度显著高于健康仔猪（10 倍），主要包括食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）和约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）。食淀粉乳杆菌在仔猪肠道分布很广泛，能够通过调节细胞因子抑制病原菌粘附小肠壁和保护膜屏障，减轻由ETEC 引起的仔猪腹泻[14]。约氏乳杆菌参与调节细胞因子IL-12 的产生，保护肠黏膜屏障，抑制大肠杆菌的附着[15]。本试验表明，乳杆菌属可能在由致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻中起到保护作用，然而还需进一步对仔猪的代谢产物等进行研究，探究乳杆菌属与仔猪腹泻的相互关系。

Yang 等[16]比较新生腹泻仔猪与健康仔猪的肠道菌群，发现腹泻仔猪肠道大肠杆菌和乳杆菌属的相对丰度都减小，与本试验结果存在一定的差异，可能与仔猪的年龄、遗传背景以及饲养环境等因素有关。

综上所述，本研究通过高通量测序技术发现了腹泻仔猪与健康仔猪粪便菌群的差异，其中某些菌群特异性的增加或减少可作为评价仔猪腹泻的参考指标，为哺乳仔猪腹泻的治疗及预防提供依据。