吴 雨，宋汝谋，陈 伟，杨忠诚，卢贤君，黄明捷，陈 祥*

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；3.安顺市畜牧技术推广站，贵州安顺 561000；4.贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州贵阳 550025）

动物的生长发育受许多因素影响，而这些因素都直接或间接受促生长激素轴的调控[1]。动物的促生长激素轴主要包括生长激素释放因子、生长激素和胰岛素生长因子[2]，其中生长激素（Growth Hormone，GH）是促生长激素轴的核心组成部分，对动物的生长发育起决定作用。GH 是一种单链多肽激素，由垂体前叶分泌，是一种生长调节类激素[3-5]。Vasilatos-younken 等[6]研究表明，GH 与其受体结合后能刺激局部组织产生胰岛素生长因子来调节骨骼肌的生长发育。进一步研究表明，GH 基因多态位点能够显著影响牛的生长发育和生产性能。谷朝勇[7]研究发现，鲁西黄牛GH 基因2 639 bp处存在碱基C→G 突变，相关分析得到等位基因B 是影响牛体尺性状的优势基因。张超等[8]研究发现，中国西门塔尔牛GH 基因的突变BB 基因型屠宰性能指标显著高于其他基因型，表明BB 基因型对西门塔尔牛生长发育有利。张艳丽等[9]研究发现，早胜牛GH 基因第2、5 外显子突变的BB 和CD 基因型对其生长阶段的体重影响均显著高于其他基因型。综上，GH 基因在其他地方品种牛上已有相关研究并取得了一些成果，但其在贵州地方黄牛上未见相关报道。关岭牛、思南牛、威宁牛、黎平牛属于贵州优良地方品种，其中的关岭牛早在1982 年就被录入《中国畜禽品种志》，是“中国五大名牛”之一[10]。关岭牛、思南牛、威宁牛、黎平牛均含有人体必需的8 种氨基酸，其肉制品蛋白质含量高，脂肪含量较低，深受人们喜爱[11]。但以上品种牛存在体格偏小、生长速度缓慢等问题，在一定程度上影响其发展[12]。故本实验以威宁牛、黎平牛、思南牛、关岭牛为研究对象，以影响生长性状的GH 基因为候选基因，筛选多态位点，为后期探究GH 基因对贵州地方黄牛生长性状的影响机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 牛血样分别采自贵州省关岭县、思南县、威宁县、黎平县，其中关岭牛82 头、思南和威宁各50 头、黎平32 头（共214 头，年龄均为2 岁）。颈静脉采血，存于抗凝管中，置-80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂 DM2000 DNAMarker、核酸染料、2Es Taq Master Mix（鼎国生物工程技术有限公司）；血液基因组提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）；双蒸水、TAE 缓冲液（实验室自备）。

1.3 血液基因组DNA 提取 采用血液基因组提取试剂盒对样品基因组DNA 进行抽提，微量紫外分光光度计检测其浓度及OD 值，用浓度为1%的琼脂糖凝胶检测其完整性。

1.4 引物设计及PCR 扩增 采用NCBI 数据库中牛GH基因的参考序列（GenBank 登录号：NC_037346），用Premier 5.0 对牛GH 基因第1、2、3、4、5 外显子设计特异性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。PCR 体系为20 μL：2×Es Taq Master Mix 10 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL（10 pmol/µL），ddH2O 5 μL。PCR 反应程序：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸30 s，72℃终延伸5 min，35 个循环。

表 1 引物序列

1.5 筛选多态性位点 采用DNA 混池方法将214 头牛种血样DNA 每份取1 μL 进行混合，混合后的总DNA取1 μL 作为模板进行PCR 扩增送到上海生工生物工程股份有限公司进行单向测序，应用DNAStar 软件中SeqMan Ⅱ程序对测序峰图进行分析比对，并与NCBI 上发布的序列进行对比分析，筛选贵州地方黄牛SNPs 位点。

1.6 等位基因频率估算 应用MWSnap 软件测量各SNPs 位点等位基因峰高。并应用公式fi= hi/（h1+h2）（i=1，2）来估算等位基因频率。其中，fi 为SNP 位点某等位基因的频率；h1、h2 分别表示测序图上等位基因1、2 的峰高。

1.7 生物信息学分析 访问ExPASy 服务器（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）分析牛GH 蛋白理化性质，访问ExPASy 服 务 器（http:www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）提交GH 蛋白的氨基酸序列，对其亲水性和疏水性进行分析，用TMHMM 软件（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测牛GH 蛋白跨膜结构，用SignalP 软件预测牛GH 蛋白信号肽，用SOPMA 软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）预测牛GH 蛋白二级结构。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取结果 用紫外分光光度计检测血液基因DNA 浓度和纯度，用含核酸染料的1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带明亮无明显拖尾（图1），可用于下一步实验。

图1 4 个牛种血液基因组DNA 提取检测结果

2.2 PCR 扩增 如图2 所示，GH 基因第1、2、3、4、5 外显子经PCR 扩增后分别获得364、359、382、421、531 bp 的目的片段，每个目的片段无杂带，特异性较好，可用作下一步测序。

2.3 测序 从4 个牛种（关岭牛、思南牛、威宁牛、黎平牛）中共检测出2个SNPs 位点（Exon5-G1570C、Exon5-A1720C），均位于第5 外显子。再分别混合每一品种牛的总DNA 取1 μL 为模板，对第5 外显子进行PCR 扩增并分别测序。如图3 所示，关岭牛、思南牛、威宁牛中均存在这2 个SNPs 位点，而黎平牛仅存在1 个SNPs 位点（Exon5-A1720C）。

2.4 等位基因频率估算 从表2 可见，Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 均发生在基因编码区，其中Exon5-G1570C 为错义突变，编码的缬氨酸突变为亮氨酸且该位点基因频率在3 个牛种（关岭牛、思南牛、威宁牛）中差别较大，威宁牛等位基因C 频率明显低于其他牛种；Exon5-A1720C 为同义突变，编码的氨基酸并未改变且4 个牛种中均发现该突变，其中黎平牛等位基因C 频率明显低于其他牛种。

2.5 生物信息学分析

图2 GH 基因PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3 GH 基因PCR 产物测序峰图及SNP 位点

表2 牛GH 基因SNPs 等位基因频率估算

2.5.1 GH 基因突变前后的mRNA 二级结构预测 GH基因突变前后的mRNA 二级结构预测结果显示（图4），编码区突变位点Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 均导致mRNA 二级结构发生改变。Exon5-G1570C 位点：自由能由-109.33 J/mol 变为-106.48 J/mol，突变后，RNA 自由能升高，稳定性降低。Exon5-A1720C 位点：自由能由-109.33J/mol 变为-110.62 J/mol，突变后，RNA 自由能降低，稳定性升高。

图4 GH 基因G5170C、A1719C 位点突变前后mRNA 二级结构的变化

2.5.2 GH 蛋白理化性质分析 如表3 所示，牛GH 蛋白相对分子质量为27 385.45，理论等电点为6.90，其中Ala、Gln、Gly、Leu、Ser、Thr 氨基酸个数均超过15，且Leu 所占比列最高，为13.10%；而Asn、Cys、His、Ile、Met、Trp、Tyr 氨基酸个数均低于10，其中Trp 所占比列最少，为0.80%。

表3 牛GH 蛋白氨基酸含量及所占比例

2.5.3 疏水性分析 由图5 可知，在第25～70、130～160位这2 个区域的氨基酸疏水值频率较密集集中，其中第48 位氨基酸疏水值最大（3.133）；在第60～128、162～243 位这2 个区域的氨基酸亲水值频率较密集集中，其中第123 位氨基酸亲水值最小（-2.767）。综上可知，整个多肽链中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明整个多肽链表现为亲水性。

图5 牛GH 蛋白疏水性分析

2.5.4 跨膜区 如图6 显示，牛GH 蛋白所包含的区域不仅在膜内且跨过膜外，故牛GH 蛋白是跨膜蛋白。

图6 牛GH 蛋白跨膜区域分析

2.5.5 信号肽预测 如图7 所示，表明牛GH 蛋白有信号肽序列，序列为MAAGPRTSLLLAFALLCLPWTQVVGA，推测GH 蛋白可能在跨膜运输起着信号识别作用，剪切位点位于第53 和第54 位氨基酸之间。

图7 牛GH 蛋白信号肽预测

2.5.6 二级结构 运用SOPMA 在线软件预测GH 基因蛋白质二级结构，预测结果可知，GH 蛋白二级结构由4 个结构组成，分别是α-螺旋、无规则卷曲、β-转角及扩展链。其中，α-螺旋占53.06%，无规则卷曲占42.04%，扩展链占2.45%，β-转角占2.45%；其中α-螺旋所占比例分别是无规则卷曲、扩展链、β-转角的1.3、21.7、21.7 倍；α- 螺旋结构主要集中在第35～44、60～88、120～140、144～152、155～181、206～220、223～234 位 置区域；无规则卷曲结构集中在第2～26、45～51、54～59、89～94、100～119、182～189、192～205、 237～244 区域；扩展链结构集中在第96～99 位置区域；β-转角结构集中在52～53、96～99 位置区域。

3 讨 论

动物的生长发育受多种激素调节，而GH 能够调节机体中大部分的脂肪、蛋白质和核酸的代谢[13]。GH主要通过2 种途径发挥作用，一是诱导肝脏、肌肉等组织的细胞产生生长激素介质发挥作用；二是直接作用于靶组织细胞发挥生理功能[14]。近年来，GH 基因已成为提高动物生产性能、生长速度等方面的研究热点之一。郝灵慧[15]研究发现，草原红牛GH 基因3´UTR 突变位点与其屠宰性状指标呈显著相关，且突变位点分型基因BB 基因型为优势基因型。李军[16]研究发现，荷斯坦牛GH 基因第5 外显子2 141 bp 处存在C→G 突变，等位基因G 对生长性能具有正效应。牛志刚等[17]研究发现，GH 基因第5 外显子的GH/Alu Ⅰ突变位点分型基因L 等位基因对新疆褐牛早期生长发育性状有正向选择作用。胡怡菲等[18]则在秦川牛GH 基因第5 外显子发现2 处SNPs，其中组合ABCD 型各体尺性状数值均高于AB 和CD 基因型，提示组合ABCD 基因型是影响秦川牛体尺性状的最佳基因型组合。高雪等[19]研究发现，牛GH 基因第5 外显子突变位点且该位点突变分型基因B 等位基因为优势等位基因。目前，关于贵州地方黄牛GH 基因多态性的研究未见报道，故本实验对关岭牛、思南牛、威宁牛和黎平牛的GH 基因进行SNP 位点检测，首次在4 个牛种中发现2 个SNPs，即Exon5-G1570C、Exon5-A1720C，这与上述研究结果相符[17-19]，均在第5 外显子发现多态位点，说明牛GH 基因在第5外显子具有高度多态性，但与前人所发现的突变位点不一致，表明不同地方的牛种具有其地方品种特点。

本研究中，2 个SNPs 均发生在编码区，其中Exon5-G1570C 为错义突变，编码的缬氨酸突变为亮氨酸，Exon5-A1720C 为同义突变，编码的氨基酸并未发生改变。而编码区核苷酸的改变会导致蛋白质结构改变而影响其功能[20]，故推测Exon5-G1570C 突变较Exon5-A1720C 突变会更大程度上改变牛GH 蛋白生理学功能。同时，黎平牛中仅存在Exon5-A1720C 位点，其余3 个品种均存在2 个突变位点，可能是相同环境条件下，经过长期人工选育、优胜劣汰使品种间差异不大或样本量不够所致，具体原因还需进一步验证。通过等位基因频率估算，在Exon5-G1570C 位点处，编码的氨基酸发生改变且该位点基因频率在3 个牛种（关岭牛、思南牛、威宁牛）中差别较大，威宁牛等位基因C 频率明显低于其他牛种；而Exon5-A1720C 位点处，编码的氨基酸并未改变且4 个牛种中均发现该突变，其中黎平牛等位基因C 频率明显低于其他牛种。由此发现，这2 个SNPs 可能与贵州地方黄牛遗传差异有关，但仍需进一步实验证实。本研究发现的突变位点均位于第5 外显子，而外显子的突变可能会引起mRNA 二级结构的变化，故对4 个牛品种GH 基因进行二级结构预测，发现Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 位点突变均会导致其二级结构变化。具体表现：当Exon5-G1570C 位点碱基发生突变，Exon5-A1720C 位点为A 或C 时，mRNA二级结构发生显著变化，稳定性减小，自由能增大；当外显子Exon5-A1720C 位点发生突变，Exon5-G1570C位点为G 或C 时，mRNA 二级结构稳定性增大，自由能减小。这说明突变位置不同，对mRNA 二级结构的变化也会不同。综上，根据本研究结果及结合前人在其他牛种上的研究成果推断GH 基因可为贵州地方牛种生长性状等标记辅助选择提供相应的分子标记。

4 小 结

本研究以贵州4 个地方牛种（关岭牛、思南牛、威宁牛、黎平牛）为实验对象，利用混池DNA 结合PCR产物直接测序法检测贵州地方黄牛GH 基因多态性，共筛选出2 个SNPs，且突变前后GH 基因mRNA 二级结构均发生改变，Exon5-G1570C 位点mRNA 自由能升高，稳定性降低；Exon5-A1720C 位点则自由能降低，稳定性升高，这表明突变位置不同，对mRNA 二级结构的变化也会不同。其中Exon5-G1570C 为错义突变，编码的缬氨酸突变为亮氨酸，Exon5-A1720C 为同义突变，编码的氨基酸并未发生改变，推测Exon5-G1570C 突变较Exon5-A1720C 突变会更大程度上改变牛GH 蛋白的生理学功能。进一步结合前人在其他牛种上的研究成果推断GH 基因可为贵州地方黄牛生长性状等标记辅助选择提供相应的分子标记，筛选出的多态位点可为贵州地方黄牛生长相关分子标记提供参考。