邹凌波，王栋*，余海燕，张立军，徐岩

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 2(湖北庐陵王酒业有限责任公司，湖北 十堰，442100)

米酒是以稻米等谷物为主要原料，利用酒曲作为糖化发酵剂酿造而成的发酵酒，是中国的传统酒精饮料[1]。我国米酒产地分布广泛，具有悠久的历史，主要有江浙地区的米酒、湖北的孝感米酒、房县黄酒等。虽然长期以来，酿造米酒基本被看作是属于黄酒的范畴，但在一些方面与中国传统典型黄酒还是有明显差异[2]，如酿造过程不添加麦曲作为糖化剂，因而米酒风味中没有麦曲赋予的典型香气和口感[3]，产品风味品质总体上似乎更接近日本的清酒[4]。

近年来，米酒越来越受到消费者的青睐，也引起了研究者的关注。中国米酒品类较多，但与黄酒[5]和日本清酒[6]较为完整的标准规范相比，米酒的生产及产品缺少系统的规范和标准，米酒品质参差不齐、难以客观评价，这一状况限制了米酒行业的进一步发展[7]。而米酒类型的合理划分是品质评价的前提。目前国内现有米酒标准只有农业部的农业行业标准[8]和一些地方标准，这些标准主要根据酒糟形态等对米酒进行简单的分类，难以反映不同种类米酒的内在品质特点。

近年来国内对米酒的研究主要集中在对米酒工艺[9]、米曲[10-13]的考察，或对某些地域性或特定原料米酒的分析[14-15]，而对于酿造米酒较为全面和系统的分类研究未见报道。本研究主要针对米酒中最主要的大米酿造米酒(不含其他辅料或添加剂的酿造酒及配制酒)进行分类及相关特性分析，为中国酿造米酒的分类提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 米酒样品

选取江浙、湖北等地市售或生产厂家提供的10种典型的酿造米酒，另选择2种不同的日本清酒样品作为对照。

1.1.2 试剂

NaCl、NaOH、三氯乙酸：分析纯，上海国药集团；2-辛醇、无水乙醇：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器

高效液相色谱仪，美国Waters公司；气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司；pH计，瑞士Mettler Toledo公司；酶标仪，美国Bio Tek公司；台式高速离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 米酒理化指标分析

米酒总酸、氨基态氮的测定方法参照黄酒国标GB/T 13662—2018[5]；

还原糖含量的测定采用DNS法[16]；

乙醇含量的测定采用高效液相色谱[17]。样品处理：样品经三氯乙酸沉淀后静置0.5 h，取上清液用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，滤液供进样。色谱条件：采用高效液相色谱仪(Waters 2695)测定，色谱柱为Aminex HPX-87H(150 mm×4.6 mm, Bio-Rad)，示差折光检测器(RI)为Waters 2414，流动相为5 mmol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，进样量 10 μL。

1.3.2 挥发性风味物质的测定

采用HS-SPME[18]结合GC-MS[19]的半定量测定方法。针对米酒特点，具体测定过程略有变化。

HS-SPME处理条件：酒样经稀释将乙醇体积分数降至2%，取9 mL置于顶空瓶中，用NaCl饱和，加入内标2-辛醇，进行顶空固相微萃取，萃取条件为：三相萃取头DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)，50 ℃预热5 min，萃取吸附45 min。

GC条件：进样量1 μL，色谱柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，载气He，流速3 mL/min。升温程序： 50 ℃保持2 min，以6 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持15 min。

MS条件： EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围35.00～350.00 amu。

化合物的定性分析：未知化合物的质谱通过与NIST05a.L Database (Agilent Technologies Inc.) 进行比对。定性结果通过与标准样品的质谱比对和查阅已经报道过的文献中相应物质RI得到。

化合物的半定量分析：依据被检测物质与内标物的浓度和吸收峰面积对应成比例求得[20]。

1.3.3 米酒口感的感官品评

米酒口感的感官品评参考GB/T 13662—2018[5]黄酒感官品评方法，由15名依照国际标准ISO—8586培训过的品评员在独立的品评间里进行品评。对米酒的基本口感特征评价按照5点标度法，分别对酸、甜、苦、鲜和涩味打分，0～5分别表示没感觉、弱、稍弱、平均、稍强、强，最终评分取平均值。

1.4 数据分析

使用Excel 2016、XLSTAT 2014等软件对实验数据进行处理和统计分析。热图分析中对各风味成分含量进行Z分数(z-score)标准化处理后利用R语言进行绘制。

2 结果与分析

2.1 米酒基本理化指标及口感分析

酿造酒的理化指标可以反映酒的基本特性和品质，通常可根据少数几个主要的指标对产品进行分类。参考日本清酒和已有的米酒标准[8]，选择较能直接反映米酒酿造特性和品质的4项主要理化指标，即还原糖、乙醇体积分数、总酸和氨基酸态氮，首先对选取的10种典型米酒样品及2种日本清酒进行检测和分析，结果如表1所示。

表1 米酒及清酒样品的主要理化指标Table 1 The physicochemical parameters of Mijiu and Sake samples

根据分析结果可以看出，由于酿造工艺及发酵条件控制等方面的差别，不同米酒理化指标差异明显，尤其是在还原糖和酒精的含量上。酒样中还原糖最低的仅为9.0 g/L，最高的可达292.6 g/L；酒精体积分数最低的仅2%左右，高的可以到达15%。根据黄酒和葡萄酒等酿造酒国家标准[5,21]，一般可根据理化指标中的含糖量对产品进行分类，当然，含糖量的分类标准并不一致。参考黄酒的含糖量分类标准[5]，尝试对这些米酒样品进行分类，则GC属于干型(≤ 15.0 g/L)、SLMZQ为半干型(15.1～40.0 g/L)、GYLS、DL、CJ、LLWFX为半甜型(40.1～100.0 g/L)、SLCMJZ、SLMJXZ、MK、LLW1为甜型(>100.0 g/L)。2个日本清酒样品如也按此分类，则HMH和HY分别为半干型和半甜型。

进一步对这些米酒样品(包括清酒)进行口感(含口味)特征感官评价，分别对酒样的酸、甜、苦、鲜、涩5种主要口感特征进行强度打分，评价结果如图1所示。可以看出，各米酒样品的口感特征差别较大。根据这种分类，即使同一类型的米酒口感差异也比较明显，而不同类型的米酒却具有类似的口感，如SLMZQ(半干型,图1-a)、GYLS(半甜型,图1-b)与大部分甜型米酒口感特征(图1-c)类似，均具有较高的甜味及一定的酸味。

a-干和半干型米酒;b-半甜型米酒;c-甜型米酒图1 米酒口感特征强度分析Fig.1 The intensity analysis of Mijiu taste characteristics

实际上，黄酒和葡萄酒等基于含糖量的分类，同时都对样品酒精含量有一定的要求，如要求传统黄酒、清爽型黄酒、葡萄酒的乙醇体积分数分别≥8.0%，6.0%或7.0%[5,21]。而中国米酒乙醇含量差异很大，如本研究的甜型米酒中最高和最低的乙醇体积分数差别超过13%，而且不少米酒乙醇体积分数<6.0%。此外，不同酿造酒含糖量的分类标准也不一致。由于米酒与黄酒产品特点不同，因此以黄酒(或者其他酿造酒)的含糖量分类标准直接用于米酒的分类可能并不太适合。

2.2 米酒的聚类分析

一般认为,目前国内的酿造米酒有如酒酿一类的甜型米酒及部分酒精度较高的纯米酒之分，但没有明确的界限标准。基于此，根据米酒还原糖和酒精含量,进一步利用XLSTAT分析软件对样品进行聚类分析，如图2所示。

由图2-a聚类分析结果可以看出，这些米酒大体可分为2类，即I类高度低糖型米酒和II类低度高糖型米酒。根据每类样品的还原糖和酒精含量(如图2-b所示)，I类高度低糖型米酒还原糖含量平均为50 g/L左右，大体类似于黄酒偏半甜的类型，酒精体积分数平均为14%左右；II类低度高糖型米酒还原糖含量平均为125 g/L左右，类似于黄酒的甜型酒，酒精体积分数平均为5%左右。这2类米酒样品酒精含量范围基本可以分开，但还原糖含量范围有一定的重叠，特别是第II类米酒，其还原糖含量的范围相对更为宽泛。这可能主要与米酒的酿造工艺不同及调配有关。2个日本清酒样品也表现出和这2类米酒类似的还原糖和酒精含量的差异，可以认为分属于这2个不同的类别。还原糖含量与酒精含量的关系实际上反映了酵母的发酵程度，较低的酒精度对应于较高的还原糖含量是容易理解的。总体而言，这样的类型划分基本反映了米酒的发酵程度。

a-聚类分析;b-两类米酒的还原糖和酒精含量范围图2 基于米酒还原糖和酒精含量的分类分析Fig.2 Classification analysis of Mijiu based on the sugar and alcohol content

依照此种分类，对照图1比较米酒的口感特征可以发现，第I类米酒口感特征仍然差异较大，表现出明显的多样性；第II类米酒基本包含了之前甜味较高、口感特征整体上比较接近的酒样，如SLMZQ、GYLS、MK、SLCMJZ、SLMJXZ等。2个日本清酒样品的口感特征总体较为柔和，但HY的甜味比较明显，也分属2类。这些结果说明，这样的类型划分也可以大体反映米酒的主要口感差异。

利用偏最小二乘回归分析(partial least squares regression，PLSR)进一步对米酒口感特征和上述4项主要理化指标间的关系进行了考察。PLSR分析中，2个变量之间的距离说明两者之间的相关性：位置越接近，正相关性越强；两者在离圆心相反的位置，负相关性越强；两者越垂直，越不相关[22]。PLSR分析结果如图3所示。

图3 米酒口感特征与理化指标的偏最小二乘回归分析Fig.3 The PLSR analysis of taste characteristics and physicochemical parameters of samples

根据分析结果，在主要理化指标中，总酸含量与其他指标相关性不大，而还原糖含量与酒精和氨基态氮含量有一定的负相关性。如前所述，这是合理的，与米酒的发酵程度有关。在口感特征中，甜味与其他口感特征相关性不大，而酸味与涩、苦、鲜味有一定的负相关性。从图3看出，总酸与酸味相关性较强，还原糖与甜味有一定的相关性，这容易理解。此外，氨基态氮含量可能也与米酒的苦味有一定的联系。由酒样的聚集程度，可以看出第II类米酒样品比较靠近，与甜味和还原糖指标也较为接近，表明这些米酒更为相似，在口感上甜味特征较为明显。而第I类米酒较为分散，表明了这类米酒的复杂性和多样性。这与之前米酒的聚类分析及口感特性分析相一致。

从图3中还可以发现，酒样LLW1与其他酒样距离较远，性质较为独特。按照还原糖含量，它属于甜型米酒；而按照还原糖结合酒精含量的聚类分析，它属于高度低糖型米酒。根据其理化指标(表1)，LLW1的还原糖、酒精含量及总酸均较高，可能是由特定工艺生产或调配而成，因而较为独特。此外，中国米酒的地域特性并不明显。

综合以上结果，按照还原糖结合酒精含量将米酒大体上分为I类高度低糖型和II类低度高糖型两类，比直接以还原糖含量进行分类似更合理。当然，随着酿造新工艺及新产品的出现，类似LLW1的产品可以在此基础上进行进一步的划分。

2.3 米酒挥发性风味成分分析及类别特性

由于目前米酒香气的感官评价术语体系尚未建立，米酒香气特征不够明确，本研究采用挥发性风味成分分析，考察不同米酒香气物质特征，推测香气品质的差异，进而进行香气风格区分。利用GC-MS对12个酒样中挥发性风味成分进行检测，各酒样含有的挥发性风味化合物种类和相对含量如表2所示。在12个酒样中共检测出46种主要挥发性成分，其中酯类化合物最多，15种；醇类10种；芳香族化合物10种；有机酸类5种；醛酮类4种；呋喃类1种；含硫化合物1种。

从表2可以看出，2类中国米酒的挥发性风味成分在种类上总体差别并不大，但含量有显著差异。I类高度低糖型米酒除个别酒样外，挥发性风味成分含量总体上要高于II类低度高糖型米酒，可能与较高的发酵程度，微生物代谢产物较丰富有关。II类米酒大部分都含有糠醛(呋喃类)和3-甲硫基-1-丙醇(含硫化合物)。糠醛的产生可能与此类米酒较高的糖含量有关，而3-甲硫基-1-丙醇会对香气产生影响，值得进一步研究。此外，中国米酒的挥发性风味成分在种类上与清酒也没有太大差异，但总体含量上却远少于清酒。如挥发性成分含量最少的米酒样品SLCMJZ和SLMJXZ，其含量仅为清酒的约15%，特别是酯类和有机酸类物质，中国米酒的含量远低于日本清酒。

基于米酒挥发性风味成分含量，对数据进行标准化处理后绘制热图(图4)，尝试对这些酒样进行分类，并比较不同类别米酒的香气物质特征与差异。

表2 米酒挥发性风味物质分析Table 2 Analysis of flavor components in Mijiu sample

注：a含量以μg/L计；b日本清酒样品。

图4 米酒挥发性风味成分热图分析Fig.4 The heat map of Mijiu’s flavor components

根据热图的聚类分析结果(图4)，这些酒样大体可分为3大类(用A、B、C表示)，且不同类别酒样挥发性风味成分差异明显。首先风味成分含量总体相对较高的3个米酒样品(CJ、GC、LLW1)聚为一类(A类)，这些酒样均为前述I类米酒。第二大类(B类)米酒样品风味成分含量相对较低，样品间差别也较大。其中II类米酒都属于此类，也有少量I类米酒。另外，2个日本清酒虽然基本理化指标差异明显，可看做是两类产品，但根据挥发性风味物质两者聚为一类(C类)，表明清酒香气特征的相似性。

利用主成分分析进一步对各米酒挥发性风味成分进行了考察，结果如图5所示。

图5 米酒挥发性风味成分的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of volatile flavor components in Mijiu注：图中风味成分的编号与图4一致

根据主成分分析，除了样品GYLS外，这些酒样也可以分为3类，与热图的聚类分析结果(图4)基本一致(以A、B′、C表示)。在A类酒样中，虽然CJ、GC、LLW13种米酒有一定的差异，但其与高级醇及短链酯类化合物等较为相关，结合热图结果，其中丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯及苯乙酸乙酯等成分的含量较为丰富，因此其香气可能较多地呈现出果香、花香和醇香等[23]。B'类酒样相对较为集中，主要与醛类和呋喃类化合物较为相关，其中3-甲基丁醛、苯乙醛、糠醛(呋喃类)和乳酸异戊酯是此类米酒中含量相对较高的共有成分。C类仍然是2个日本清酒，相关的主要挥发性香气成分以有机酸和酯类化合物为主，主要包括己酸、辛酸、癸酸和己酸乙酯等。

根据以上分析，不包括清酒，中国米酒基于挥发性风味成分的分类结果与仅按照还原糖含量的分类结果差异较大，但与基于还原糖结合酒精含量的分类结果有较好的相关性。比较A、B两类中国米酒的划分与之前基于还原糖结合酒精含量的I、II类型划分，可以发现，A类米酒均属于I类米酒，相关的主要风味成分如高级醇等与较高的发酵程度相关。而B′类米酒主要是II类米酒(除GYLS外)，也包括少量I类米酒(DL和LLWFX)。由表2可知，II类中国米酒风味成分总体含量较低，而GYLS是其中含量最高的样品；相反，DL和LLWFX则是I类酒样中风味成分总体含量最低的2个。除了酿造工艺的差异外，这些样品也可能经过较大程度的调配勾兑，从而造成风味成分的明显改变和类型差异。但总体而言，对中国米酒类型的这两种划分还是具有较好的相关性，高度低糖和低度高糖的米酒分类能大体对应米酒香气和风格的差异。当然，结合主要风味成分还可以进行更细致的分类。米酒产品的地域特性仍然没有发现。

另外，比较我国米酒和日本清酒在风味成分上的差异可以发现，日本清酒含有更多的挥发性酸类化合物(辛酸、己酸、癸酸等)，酯类物质的含量也远高于中国米酒。其中乙酯类物质(己酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯等)，能给清酒带来水果香、花香、蜂蜜香等令人愉悦的香气[4,24]。酸味和香气的协调也是清酒的一大特色[25-26]，这些感官特性是中国米酒较为欠缺的。中国米酒的高级醇(异丁醇、异戊醇)含量相对较高，特别是大部分I类米酒，过高的醇含量会给酒带来杂醇油和酒精的气息[24]。此外，部分中国米酒的醛酮类化合物含量相对较高，使得米酒的香气更为复杂，一些不饱和醛可能会带来较刺激的气味[24]。

综合以上结果，中国米酒根据挥发性风味成分分类与之前根据还原糖结合酒精含量的分类结果有较好的相关性。研究结果也说明中国米酒的特点可能主要与生产工艺相关，地域特性并不显著。

3 结论

本研究对照日本清酒样品，对10个具有不同典型性的中国酿造米酒进行了基本理化指标、口感特征及挥发性风味成分分析，研究了中国米酒可行的分类及其相关特性，探讨了不同成分与米酒类型的关系。由于不同米酒较为宽泛的还原糖和酒精含量范围及对应的口感特性差异，直接以还原糖含量进行类型划分不太合适。基于米酒还原糖结合酒精含量的聚类分析结果，可以较明显地将中国米酒分为I类高度低糖型和II类低度高糖型两个类别。通过基本理化指标和口感特征的PLSR分析，能较明显地看出各酒样之间的口感差异与部分理化指标间的相关性。其中第II类米酒多为突出的甜味，口感大体较为接近；而I类米酒口感复杂而多样。综合分析，这一分类相对更为合理。

利用GC-MS对米酒样品的挥发性香气成分进一步进行了检测，其中II类米酒的挥发性风味成分总体含量明显较低。基于挥发性风味物质的相似性聚类，中国米酒与日本清酒可以较明显地区分，并也可分为2大类：A类具有较高的醇类和酯类化合物含量，均为I类米酒；B类风味成分含量总体较少，但醛类和呋喃类化合物相对较为丰富，主要是II类米酒。这一分类结果与基于还原糖含量的分类结果差异较大，而与基于还原糖结合酒精含量的分类结果有较好的相关性。此外，与日本清酒相比，中国米酒的酸类和酯类化合物含量相差较多，可能会带来水果香、花香等香气的不足；中国米酒的高级醇含量相对较高，特别是I类米酒，也可能对米酒品质有一定影响。中国米酒的地域特性并不显著。

基于以上研究结果，我国米酒可以基于还原糖结合酒精含量等主要指标进行基本的类别区分，可以大体对应米酒香气和产品风格。当然，由于酿造技术的差异以及酿造新工艺、新产品的出现，可进行更细致的分类。本研究的分析方法和结果可以为中国酿造米酒的分类提供依据。