李彦林，张蔚，李晓玉，鲁心怡，曹钰*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 2(教育部工业生物技术重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)

当前，全球表面活性剂的使用量大幅增加，每年化学和生物表面活性剂的全球市场价值超过200亿美元[1-2]。和化学表面活性剂相比，生物表面活性剂是微生物发酵产生的生物活性分子，具有较低的毒性和较高的生物降解性，并且能够在极端的温度、pH和盐度下保持表面活性[3]。

Surfactin是由C12—C17长链脂肪酸和7个氨基酸构成的环状脂肽，为研究最多的脂肽类表面活性剂之一，具有保湿[4]、抑菌[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]等活性，甚至可以辅助治疗人类免疫缺陷病[8]，在化妆品、食品、医药等领域具有广阔的应用前景。但其工业化进程受制于较高的生产成本。通常在发酵类产品的生产中，原材料成本约占总成本的41%[9]。因此使用廉价的工农业废弃物作为碳源来发酵生产surfactin，在降低生产成本方面扮演重要角色。目前已有以梨汁[10]、橄榄油场废料[11-12]、木薯废水[13]、白酒糟[14]、过期糖蜜[15]、豆渣[3]作为碳源的文献报道。啤酒糟(brewer's spent grain，BSG)是在啤酒生产环节麦芽汁加工过程残留的固体物质。全球每年BSG产量约3 860万t[16]，其中我国年产量约1 000万t[17]，具有丰富的资源。目前BSG主要用于动物饲料[18]，亟待高附加值的开发利用。

本研究主要根据surfactin的表面活性性质，以及生产菌株具备的surfactin合成调控基因srfA，开展surfactin合成菌株的定向筛选，通过薄层层析(thin layer chromatography，TLC)和超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight high-resolution/mass spectrometry，UPLC-ESI/Q-TOF/MS)进行产物的定性验证和定量分析，筛选利用BSG酶解液为碳源的surfactin高产菌株，并进行分子生物学鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无锡雪浪山附近筛选得到的247株芽孢杆菌，实验室保藏。

surfactin(≥98%)标准品S3 523,美国sigma公司；甲醇、乙腈(HPLC级),赛默飞世尔科技有限公司；三氟乙酸(HPLC级),上海麦克林生化科技有限公司；普通PCR制剂,Takara公司；其他试剂,国药集团(上海)化学试剂有限公司。

1.2 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10。制备固体培养基时添加2%营养琼脂，pH 7.0。

MSM培养基(g/L)：葡萄糖40，NH4NO38，KH2PO44.08，Na2HPO45.68，MgSO4·7H2O 2.46×10-2，CaCl21.03×10-3，FeSO41.11×10-3，EDTA 1.18×10-3，pH7.0。

发酵培养基：用5 g/L预处理BSG的酶解液替代MSM培养基中葡萄糖。

1.3 仪器与设备

LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；T100 PCR仪，美国Bio-Rad公司；TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂；GSP-9050MBE隔水式电热恒温培养箱，上海博迅实业有限公司；ZQZY-70B振荡培养箱，上海知楚仪器；PA2014N电子天平，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏净安泰空气技术有限公司；DCAT21表面张力动态接触角测量仪，德国Dataphysics公司；Chromaster高效液相色谱仪，日本日立公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪，美国waters公司。

1.4 方法

1.4.1 发酵上清液性质测定

基于surfactin的表面活性特性，通过无细胞发酵上清液排油活性、乳化指数及表面张力性质的测定，初步筛选产生物表面活性剂的菌株。即将筛选得到的247株芽孢杆菌接种于MSM培养基中30 ℃，200 r/min摇瓶培养96 h，发酵液于10 000 r/min离心5 min得到无细胞上清，进行性质测定。

1.4.1.1 排油活性(ODA)测定

取30 mL蒸馏水于培养皿中，加20 μL大豆油于蒸馏水表面，形成油层之后，滴加10 μL无细胞上清液，若能够形成透明圈，说明有表面活性物质产生，并记录透明圈直径大小。

1.4.1.2 乳化指数(E24)测定

以乳化指数来表征无细胞上清液的乳化能力。取2 mL大豆油于试管中，然后加入2 mL无细胞上清液，旋涡高速振荡2 min后，在室温下静置24 h，计算乳化指数E24：

(1)

式中：h1，乳化层高度；h2，液体总高度。

1.4.1.3 表面张力(SFT)测定

利用德国Dataphysics公司表面张力动态接触角测量仪测定无细胞上清液表面张力。取40 mL无细胞上清液于烧杯中，放置到张力计检测品台上，按照说明书方法进行操作。测定不同样品之间需用无菌的MSM培养基进行洗涤后测定。

1.4.2srfA基因特异PCR分析

经过发酵液性质测定，选择初步确定能产表面活性剂的菌株。进行srfA基因检测，进一步确定菌株是否具有合成surfactin合成酶的能力。PCR扩增引物及条件参照文献[19]。

1.4.3 发酵产物分析

向无细胞上清液中添加5 mol/L的HCl调节pH至2.0，放于4 ℃冰箱过夜，10 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用甲醇溶解后备用。

1.4.3.1 薄层层析(TLC)

通过TLC初步半定性半定量surfactin的产生，使用Merck硅胶60荧光薄层层析铝箔板F254进行薄层层析，流动相为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸)=80∶10∶10，surfactin标品作为对照。

1.4.3.2 UPLC-ESI/Q-TOF MS条件

液相条件：使用Waters C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A为含有体积分数为0.1%甲酸的色谱乙腈溶液，流动相B为含有体积分数为0.1%甲酸的水溶液，V(A)∶V(B)=90∶10等度洗脱；柱温30 ℃，流速为0.3 mL/min；进样体积5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式；离子源温度为20 ℃；毛细管电压3 000 V；锥孔电压30 V；去溶剂气体流速500 L/h；去溶剂温度500 ℃；锥孔气流50 L/h；范围m/z500～1 500，检测时间20 min。

1.4.4 surfactin定量检测

采用高效液相色谱仪对surfactin进行定量测定。色谱柱：Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为含有体积分数为0.1%三氟乙酸的色谱乙腈溶液，流动相B为含有体积分数为0.1%三氟乙酸水溶液，V(A)∶V(B)=90∶10等度洗脱；柱温30 ℃，流速为1 mL/min；检测波长205 nm；进样体积20 μL。

1.4.5 利用预处理BSG酶解液中发酵生产surfactin

参考文献[20]BSG酶解条件，酶解完成后，100 ℃灭酶10 min，酶解液处理方式分为2种，一种是10 000 r/min离心5 min，得到BSG酶解上清液(supernatant of enzymatic hydrolysate of BSG，SEH-BSG)，另一种纱布过滤得到BSG酶解滤液(filtrate of enzymatic hydrolysate of BSG，FEH-BSG)，配制发酵培养基，121 ℃灭菌20 min。按照10%接种量接入菌株，30 ℃，200 r/min培养96 h，测定surfactin产量，选出利用BSG酶解液最好的菌株。

1.4.6 发酵产物纯化及保湿性测定

发酵产物纯化方法参照文献[21]，保湿性测定参照文献[22]。

1.4.7 菌株鉴定

1.4.7.1 菌株形态观察

活化菌株，挑取芽孢杆菌新鲜培养物，进行革兰氏染色和芽孢杆菌显微形态观察；同时在LB平板划线，培养观察菌落形态。

1.4.7.2 菌株16S rDNA分析

采用细菌基因组抽提盒提取芽孢杆菌总DNA，使用通用引物27F和1 492R对菌株16S rDNA进行PCR扩增，目标片段1 500 bp左右，PCR条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，72 ℃修复延伸5 min，10 ℃保温。PCR产出纯化后，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 产surfactin菌株定向筛选

2.1.1 基于发酵上清液表面活性特性的初筛

Surfactin是一种生物表面活性剂，具有表面活性剂的典型特征，即排油活性(ODA)、乳化指数(E24)和降低水表面张力(SFT)，SFT值越低，表明表面活性越强，ODA与E24值越大。据此，从247株芽孢杆菌的MSM培养基发酵培养上清液中共筛选出17株同时具有上述3种特性的菌株，测定结果如图1。

图1 不同菌株发酵上清液的表面活性特性分析Fig.1 The surface activity parameters of different strains’ fermentation supernatant

以无菌的MSM培养基为对照，发现菌株41-3发酵液降低培养基SFT值，提高培养基ODA和E24值效果最好，表明该菌株合成生物表面活性剂能力最强，有可能是surfactin高产菌株。

2.1.2 基于菌株srfA基因特异PCR的复筛

由于srfA是编码surfactin合成酶的基因，缺失srfA基因，surfactin将不能合成。具有表面活性剂典型特征的17株芽孢杆菌进行srfA基因检测，如图2所示，发现有8株芽孢杆菌srfA基因阳性，编号分别为20-2，41-3，43-3，44-3，47-3，49-5，50-1，56-2。

M-maker2000；1～17分别代表菌株9-1,19-1,34-2,41-3,20-2,43-3,44-3,15-1,44-1,47-3,49-5,51-5,46-3,68-1,50-1,56-2,60-1图2 不同菌株srfA基因特异性PCR分析Fig.2 Analysis of srfA gene specific PCR in different strains

2.2 利用BSG的高产菌株的选择

将srfA基因检测阳性的8株芽孢杆菌接种到基础培养基中30 ℃培养96 h，经酸沉，甲醇溶解，通过TLC和UPLC-ESI/Q-TOF MS定性分析菌株的发酵产物中是否含有surfactin。通过HPLC定量测定surfactin。

2.2.1 发酵产物的定性分析

2.2.1.1 TLC法定性分析发酵产物

如图3所示，菌株41-3发酵液提取物和sigma公司surfactin标品(S3 523)经薄层层析板的条带一致，有相同的Rf值。表明发酵液中含有surfactin。故进一步进行UPLC-ESI/Q-TOF MS分析，以明确该产物是否为surfactin。

1- surfactin标品(S3 523)；2-菌株41-3发酵液提取物图3 紫外254nm波长下样品的TLC分析结果Fig.3 TLC results of samples at UV 254 nm

2.2.1.2 菌株41-3发酵液提取物中surfactin定性分析

利用UPLC-ESI/Q-TOF MS液质连用法，对菌株41-3发酵液提取物中的surfactin进行定性分析。结果见图4。从图4可见，surfactin标品(S3 523，Sigma公司)和菌株41-3发酵提取物均为一些同系物，其[M+H]+峰均位于1 008、1 022、1 036、1 050、1 064m/z，[M+Na]+峰均位于在m/z1 030、1 044、1 058、1 072、1 086，分别代表C13—C17surfactin同系物。

a-surfactin标准品；b-菌株41-3发酵提取物图4 液质联用分析样品的[M+H]+和[M+Na]+质谱图Fig.4 Comparison of [M+H]+ and [M+Na]+ spectra of samples by LC/MS analysis

2.2.2 surfactin高产菌株的筛选

根据不同浓度的surfactin标品配置的标准溶液，绘制出surfactin标准曲线。得到surfactin浓度与峰面积的对应关系：

Y=2×10-5X峰面积-0.966 7，R2=0.999 1

(2)

式中：Y，surfactin浓度质量浓度，g/L;X,峰面积。

对8株产surfactin的菌株以MSM培养30 ℃，200 r/min发酵96 h，HPLC测定其产量，结果见图5。其中菌株41-3 surfactin产量最高，达到541.32 mg/L。其次为菌株43-3，其surfactin产量达到258.39 mg/L，其余菌株发酵产量均不到100 mg/L。据文献报道，通常天然分离的芽孢杆菌surfactin产量为100 mg/L左右，而菌株41-3 surfactin产量达到541.32 mg/L，故选用菌株41-3作进一步研究。

图5 不同菌株在MSM中surfactin产量Fig.5 Surfactin production of different strains in MSM

2.2.3 利用BSG产surfactin菌株surfactin产量及同系物成分分析

2.2.3.1 利用BSG产surfactin菌株surfactin产量

为考察菌株对BSG的发酵利用情况，采用10 g/L的NaOH稀碱溶液预处理BSG，去除木质素便于纤维素酶更好地水解纤维素，以酶解液中的还原糖供菌株生长和发酵并生产surfactin。选取菌株在MSM培养基中surfactin产量最高的菌株41-3和43-3，进行BSG发酵试验，结果见表1。

表1 菌株利用BSG酶解液发酵试验Table 1 Fermentation results by using BSG enzymatic hydrolysate

从表1中看出，相比于MSM培养基，菌株41-3和43-3在SHE-BSG酶解液(无固形物)中培养，surfactin产量分别下降了34.93 mg/L、26.89 mg/L。然而，菌株41-3和43-3在FEH-BSG酶解液(含固形物)中培养，surfactin产量相比于MSM培养基均有提高，特别是菌株41-3 surfactin产量达到746.35 mg/L，提高了1.38倍，同时生物量和MSM培养基培养相比，也从1.85×107CFU/mL提高到7.15×107CFU/mL。可能原因是BSG酶解完成后，FEH-BSG酶解液含有固体BSG颗粒，而且有报道称，固体物质能够使菌体吸附，提高生物量，进而提高surfactin产量[23]。

2.2.3.2 不同碳源条件下发酵产物中surfactin同系物分析

根据UPLC-ESI/Q-TOF MS样品出峰时间和质荷比对应关系，对发酵产物中的surfactin各同系物的相对含量进行分析，结果见表2。

表2 利用不同碳源发酵产的surfactin同系物分析Table 2 Analysis of surfactin homologues produced by fermented with different carbon sources

从表2可以看出，菌株41-3产生的surfactin同系物中，以脂肪酸链为C14和C13的surfactin为主，两者含量约占75%。利用FEH-BSG酶解液和利用葡萄糖发酵生产surfactin相比，surfactin的合成向更长链脂肪酸surfactin迁移。有文献报道，surfactin的表面活性会随着脂肪酸链的增长而显著提高，同时其乳化，保湿性能也有所增强[24-25]。分别以FEH-BSG酶解液和葡萄糖为碳源发酵，对获得的surfactin进行表面活性特性分析，结果见表3。利用前者生产的surfactin同系物的表面张力、乳化指数以及保湿性均优于后者，其中，表面张力降低了6.31%，乳化指数和保湿性分别提高了7.53%和48.04%。因此，FEH-BSG酶解液作为碳源时不仅提高了surfactin产量，也增强了surfactin的表面活性性能，可以作为葡萄糖的替代品用来发酵生产surfactin。

表3 利用不同碳源发酵产的surfactin表面活性分析Table 3 Surface activity analysis of surfactin produced by fermented with different carbon sources

2.2.4 高产surfactin菌株鉴定

2.2.4.1 菌株41-3形态观察

菌株41-3为革兰氏阳性菌，菌落易挑起，呈白色，表面粗糙不透明。菌体细胞呈杆状，能够形成芽孢，芽孢呈椭圆状，位于细胞中央。图6-a为菌株平板形态，图6-b为菌株细胞革兰氏染色后油镜下的显微镜形态。

a-平板菌落形态；b-细胞显微形态图6 菌株41-3平板菌落形态和细胞显微形态Fig.6 Colony morphology and cell microscopic morphology of strain 41-3

2.2.4.2 菌株41-3分子生物学鉴定

以通用引物27F和1 492R对41-3菌株16s rDNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到大约为1 500 bp的条带，如图7。

1- DNA分子标记；2- PCR产物图7 菌株41-3 16S rDNA的PCR结果Fig.7 16S rDNA PCR results of strain 41-3

PCR产物经纯化后，送样测序，经过NCBI数据库BLAST序列进行同源性比对，发现41-3菌株与Bacillussubtilis具有99%的同源性，亲缘关系最近，由此可确定菌株41-3菌株为Bacillussubtilis(枯草芽孢杆菌)。在NCBI数据库中下载相似度高的序列，利用MEG6软件构建进化树，如图8。

图8 菌株41-3进化树Fig.8 The phylogenetic tree of strain 41-3

3 结论

Surfactin是目前发现的最有效的生物表面活性剂，但生产成本过高限制了其工业化生产，筛选高产surfactin生产菌株及降低生产原料成本势在必行。

本研究根据surfactin性质及其编码基因，通过TLC和UPLC-ESI/Q-TOF MS定性定量分析，筛选分离得到1株surfactin产量较高的菌株41-3。经过形态学观察和16S rDNA分子生物学实验，菌株41-3为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。另外，在MSM培养基中，枯草芽孢杆菌41-3surfactin产量为541.32 mg/L。然而，使用BSG酶解液作为碳源发酵生产surfactin，surfactin产量提高了1.38倍，达到746.35 mg/L。经过同系物分析比较，以BSG酶解液为碳源生产surfactin，长脂肪链的同系物含量提高，意味着BSG不仅仅可以作为碳源生产surfactin，而且surfactin的生物活性也随着长脂肪链的同系物含量提高而增强。