秦磊磊　李素媛　黄龙　江一飞　刘健　罗爱玲

摘要：通过对魔芋膳食纤维微生物项目检测，用标准稀释液配方进行优化改良，使样品稀释后的黏度降低，提高样品稀释液流动性，增加样品稀释后的均匀性，确保检测结果的准确性。结果表明，甘油的浓度为30%～40%，NaCl的浓度为0.85%时所组成的稀释液效果最佳，该样品稀释液保持良好流动性的时间能够较好地满足试验需要，使用该稀释液配方进行相关项目检测时，具有较好的适用性。

关键词：甘油;魔芋膳食纤维固体饮料;微生物;稀释液选择;适用性

中图分类号：TS207.4         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）11-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.11.027           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The selection and applicability research on the diluent for konjac solid beverage microbiological item

QIN Lei-lei，LI Su-yuan，HUANG Long，JIANG Yi-fei，LIU Jian，LUO Ai-ling

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center，Yichang 443000，Hubei，China）

Abstract： The standard diluent formula of the konjac dietary fiber microbial project was optimized to reduce the viscosity after dilution， improve the fluidity of the sample diluent， increase the uniformity of the sample dilution， ensure the accuracy of the test results. The applicability of the improved diluent was studied through comparative experiments. the diluent consisting of glycerol at the concentration of 30%～40% and NaCl at the concentration of 0.85% had the best effect， and the time of maintaining good fluidity of the diluent could meet the needs of the experiment. The diluent formula had a good applicability in the detection of related items.

Key words： glycerin; konjac dietary fiber solid drinks;microorganism;selection of diluent;applicability

魔芋又名蒟蒻，是天南星科魔芋屬多年生草本植物，中国魔芋种植面积较大[1]。湖北省为中国魔芋重要种植区，素有中国魔芋看湖北，湖北魔芋看鄂西的说法，是典型的小作物，大产业。魔芋富含大量的膳食纤维，因其独特的保健功能被称为“第七大营养素”[2]，具有良好的调节肠道、预防心血管疾病、控制体重、防治糖尿病、调节脂质代谢等功能[3]。魔芋膳食纤维具有良好的亲水性、凝胶性，因此作为添加剂在食品工业中被广泛使用[4]。魔芋膳食纤维固体饮料因其良好的功能性、冲调性与便利性受广大人群所喜爱。

固体饮料是即冲即饮型食品，如果微生物超标将会严重威胁到人们的身体健康和生命安全[5]，因此对固体饮料产品微生物进行控制至关重要。但是魔芋膳食纤维亲水性强、易凝胶，按照国家标准方法对其微生物卫生指标进行检测时，样品稀释后快速形成凝胶，稀释液的均匀性与流动性极差，后续试验无法正常操作，不能获得准确真实的检测数据，对产品的质量安全控制评估造成了非常大的困难，产品的质量存在一定的安全隐患。通过试验，添加一定比例的甘油，使魔芋膳食纤维稀释液在一定时间内保持较好的流动性，从而保证试验的顺利进行，同时确定了稀释液中甘油的添加比例，并研究了改良后稀释液的适用性。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

魔芋膳食纤维固体饮料;实验室自分离菌株1-32，魔芋膳食纤维固体饮料产品中分离;大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E.c）CMCC44102，中国医学细菌保藏管理中心;金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.a）CMCC26003，中国医学细菌保藏管理中心;甘油，西陇科技;氯化钠，西陇科技;平板计数培养基，海博生物;菌落总数质控样品、大肠菌群质控样品、金黄色葡萄球菌质控样品，中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2  设备

LRH-250型生化培养箱，广东韶关医疗器械;BXM-50型灭菌锅，博迅;Bio-ⅡA型生物安全柜;ME2002型电子天平，梅特勒DV2T型黏度计，博勒飞。

1.3  方法

1.3.1  黏度测定  量取500 mL 30 ℃的生理盐水注入500 mL烧杯中，然后将烧杯放入（30±1） ℃恒温水浴槽，将搅拌器放入烧杯中开启搅拌，调整转速至150 r/min。称取5.00 g待测样品，缓缓加入烧杯中，搅拌1 h后停止，取出烧杯，用4号转子测定，0.5 h重复一次，直至黏度值达到最大值并明显开始下降[6]。

1.3.2  改良稀释液的配制  分别称取20、25、30、35、40 g甘油于燒杯中，加0.85%生理盐水混匀后定容至100 mL，121 ℃、0.1 MPa灭菌15 min，取18 mL于烧杯中，加入2 g高黏度魔芋膳食纤维固体饮料，充分混匀，记录稀释液保持良好流动性时间，用不同浓度甘油-生理盐水稀释液代替蒸馏水按照“1.3.1”进行魔芋膳食纤维固体饮料黏度测定，同时测定稀释液黏度。

1.3.3  菌种的制备  将实验室自分离菌株1-32、大肠埃希氏菌CMCC44102、金黄色葡萄球菌CMCC26003分别转入营养肉汤中[7]，36 ℃培养24 h，待菌种复苏后营养琼脂36 ℃培养24 h纯化菌落，挑取单个菌落36 ℃培养24 h。挑取新鲜培养物制备成0.5麦氏浊度菌悬液，并逐级稀释至菌悬液浓度约为106、105、104、103、102、10 cfu/mL，备用，吸取上述相同浓度菌悬液各1 mL，充分混匀。

1.3.4  验证

1）抑制性评价。分别使用25 mL 0%、30%、35%、40%甘油-生理盐水无菌稀释液代替样品，加入225 mL相应甘油浓度稀释液中，接种1 mL混合菌悬液，每个接种水平做6平行，按照GB4789.2-2016[8]进行菌落计数，检测结果取对数，以稀释液中甘油浓度为变量，使用Excel对试验结果进行方差分析。

2）准确度。称取25 g灭菌魔芋膳食纤维固体饮料于无菌均质袋中，加入225 mL甘油稀释液，分别接种1 mL悬液，每个水平2平行[9]，采用GB4789.2-2016进行菌落总数检测。用25 mL无菌生理盐水替代样品加入225 mL无菌生理盐水稀释液作为参比对照;使用25 mL无菌甘油-生理盐水稀释液替代样品加入225 mL相应甘油浓度稀释液作为样品空白对照。检测结果取对数，评价改良稀释液结果与参比对照结果相对误差。

3）质控样品试验。将西林瓶中冻干粉取出，与25 g灭菌膳食纤维固体饮料混匀，使用改良稀释液冲洗西林瓶内壁，合并冲洗液与剩余稀释液，将冻干粉与魔芋膳食纤维固体饮料混合物加入混匀，此为样品原液，按照质控样品说明书指定方法进行检测，最终结果转化为西林瓶中菌落数总量（cfu）=原液菌浓度（cfu/mL）×225（mL）。

2  结果与分析

2.1  甘油对稀释液黏度的影响

由于工艺及产品规格不同，魔芋膳食纤维中葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）含量不同，魔芋膳食纤维固体饮料黏度存在一定差异，测定6批次魔芋膳食纤维1%生理盐水溶液黏度，黏度在1 800～37 500 MPa·s（表1）。

KGM含量超过5%时为KGM强凝胶[10]，KGM大分子中含有大量的羟基等亲水性基团，通过分子间作用力与水分子相结合[11]，添加一定浓度的甘油后稀释液极性降低，KGM在甘油中溶解度降低，其主分子链未完全展开，没有溶胀溶解[12]，葡甘聚糖与水分子间相互作用力减弱，形成凝胶时间有所延长。1% KGM 在一定甘油添加量的溶液中黏度显著下降，因甘油本身具有一定黏性，甘油添加量超过25%后溶液本身黏度略有上升。稀释液甘油浓度大于30%时，黏度37 500 MPa·s样品10倍稀释液保持良好流动性时间达10 min以上，可满足微生物检测需要，确定稀释液配方为每100 mL稀释液含甘油30～40 g、NaCl 0.85 g（表2）。

2.2  抑制性评价

用产品中分离芽孢菌、大肠埃希氏菌及金黄色葡萄球菌混合菌株污染样品模拟产品菌相构成，以稀释液甘油浓度为变量，对不同浓度甘油稀释液检测结果进行方差分析，检测结果以10倍稀释液为原液计，评估甘油添加量对不同接种水平试验结果的影响（表3）。表4方差分析显示，102～105 cfu/g接种水平下，F值分别为1.626、1.507、1.486、0.934，当给定α=0.05时，F0.95（3，20）=3.098，不同接种水平F值均小于F0.95（3，20），表明检测魔芋膳食纤维固体饮料菌落总数时，不同甘油添加量之间无显著差异，30%～40%甘油-生理盐水稀释液与生理盐水稀释液检测结果无显著差异，按照标准流程检测，适量甘油对产品菌相中芽孢菌、大肠埃希氏菌及金黄色葡萄球菌无明显抑制作用，可用以改良魔芋膳食纤维固体饮料微生物检测用稀释液。

甘油通常作为菌种保藏防冻剂使用，方光远等[13]使用85%甘油-生理盐水-20 ℃保存枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡大肠杆菌，3株菌均保存4年仍有活力;钟志宏等[14]将8份甘油与2份生理盐水混匀后用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等24株菌的冷冻保存。部分微生物可利用甘油作为碳源，甘油对细菌抑制作用较小，在检测过程中，微生物在甘油稀释液中接触时间短，移取30%～35%甘油稀释液1 mL注入20 mL培养基后培养物中甘油含量仅为0.015～0.020 g/mL，含量极低，经过前期魔芋膳食纤维固体饮料产品菌相分析，产品优势菌为芽孢菌[15]，芽孢菌对环境有较强的抗性，且产品经过高温加工水分含量较低，通常以芽孢形式存在，与一定含量甘油短时间内接触不会被抑制或灭活，方差分析也证明一定浓度甘油稀释液与生理盐水稀释液检测结果无明显差异。

2.3  准确度

分别使用5株来自样品中分离的优势菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌人工污染样品，对接种不同水平的样品分别采用30%、35%、40%甘油-生理盐水稀释液进行菌落总数计数，菌落总数以10倍稀释液为原液计，菌落计数服从泊松分布，对检测结果取对数转换为正态分布数据[16]，检测结果如表5所示。根据表5可知，接种水平在103～105 cfu/g时，使用不同浓度甘油稀释液检测结果与参比对照结果相对误差仅两组超过10%，具有较高的准确性，接种水平为102 cfu/g时，42组试验中14组与参比对照相对误差超过10%，检测结果存在较大波动，主要原因是低接种水平微生物分布均匀性较差，样品的加入也会导致样品稀释液终体积及取样体积有所差异，取样过程中误差较大，且存在一定的随机性。接种水平103～105 cfu/g时，不同甘油浓度稀释液检测结果也具有较好的一致性，甘油浓度变化对检测结果无明显影响。

样品空白对照与参比试验结果相对误差在103～105 cfu/g接種水平下均小于10%，102 cfu/g接种水平下，42组试验仅4组相对误差超过10%，但仍在15%以内（表6）。

2.4  质控样品试验

分别使用30%、35%、40%甘油-生理盐水稀释液对质控样品进行检测，检测结果见表7。由表7可知，3个甘油稀释液测定结果均在特性值区间范围内，符合质量控制需求，稀释液中添加一定量的甘油对质控样品检测结果无影响，操作过程中，30%～40%甘油对质控样品中微生物抑制性影响不大。

3  结论

稀释液甘油含量>30%时，可在一定时间内有效改善魔芋膳食纤维固体饮料10倍稀释液的流动性，提高样品的均匀性，满足微生物项目检测的时间要求。抑制性试验表明，102～105 cfu/g接种水平下，不同浓度甘油-生理盐水稀释液检测菌落总数结果无显著差异，采用质控样品验证时，实测值均能在特性值区间，满足质量控制要求，对比试验中，接种水平103～105 cfu/g时，30%～40%甘油-生理盐水稀释液检测结果与参比试验均有较好的一致性，回收水平较高，102 cfu/g接种水平时，部分试验组结果与参比试验结果相对误差较大，考虑参比对照试验中未加入魔芋膳食纤维，稀释液体系存在一定差异，且低菌含量水平下，取样造成误差较大，但通过改良稀释液样品空白与参比试验结果，在不添加样品情况下，低接种水平改良稀释液样品空白与参比试验结果相对误差明显降低，说明低接种水平下，主要误差来源于稀释液体系的差异，受甘油的影响不大，综合考虑，30%～40%甘油-生理盐水稀释液在低污染水平下也具有一定的适用性。

30%～40%甘油-生理盐水稀释液均能有效解决稀释液凝胶速度快的问题，且具有良好的适用性，能够满足产品质量控制需求。考虑试验成本，改良稀释液配方可为每100 mL稀释液含甘油30 g、NaCl 0.85 g。由于检验人员操作熟练程度不同，不同批次魔芋膳食纤维固体饮料葡甘聚糖含量有一定差异，凝胶速度有所不同，建议在试验前通过预试验确定最佳甘油添加比例，40%甘油-生理盐水稀释液对凝胶形成的延缓时间基本能够满足目前大多数产品检测需要，但不排除有更高黏度样品存在，当甘油添加量超过40%时，需重新对改良稀释液适用性进行评估。

参考文献：

[1] 黄明发，张盛林.魔芋膳食纤维保健作用研究进展[J].中国食物与营养，2010（5）：75-77.

[2] 陈  筠.膳食纤维的保健功能及在食品添加中的应用[J].北京农业，2012（6）：154-155.

[3] 周  坚，肖安红.功能性膳食纤维食品[M].北京：化学工业出版社，2005.52.

[4] 邹新禧，谢美然.魔芋葡甘聚糖的研究进展[J].现代化工， 1992（12）：15-17.

[5] 邓全道.出口固体饮料的卫生质量控制[J].食品科技，2014（1）：50-52.

[6] NY/T 494-2010，魔芋粉[S].

[7] 赵  晖，李家勇，李  晶，等.单核细胞增生李斯特菌脂肪酸组分的气相色谱—质谱分析[J].化学与生物工程，2008，25（11）：68-71.

[8] GB 4789.2—2016，食品安全国家标准  食品微生物学检验菌落总数测定[S].

[9] 李  宏，雷质文.食品微生物检测方法确认和证实手册[M].北京：中国质检出版社，2013.22-24.

[10] 贺  攀.魔芋葡甘聚糖的溶胶凝胶机理及应用基础研究[D].四川绵阳：西南科技大学，2012.

[11] 王莉莉.魔芋葡甘聚糖的提取及其在酸乳中的应用研究[D].合肥：安徽农业大学，2014.

[12] 马建龙，戴荣继，潘  琳，等.制备方法对魔芋葡甘聚糖溶解速率的影响[J].高分子材料科学与工程，2010，26（11）：52-55.

[13] 方光远，张志成，晏文梅.几种不同条件下细菌菌种保存试验[J].金陵科技学院学报，2004，20（3）：30-32.

[14] 钟志宏，李启星，唐小异，等.甘油保存菌种方法的改良[J].实用预防医学，2005，12（3）：670-671.

[15] 刘  健，秦磊磊，李素媛，等.魔芋膳食纤维固体饮料中优势菌的分离、初步鉴定及菌相分析[J].湖北农业科学，2018，57（14）：60-63.

[16] 国家药典委员会.中国药典[M].2015版.北京：中国医药技术出版社，2015.385-387.