木尼热·库尔班，唐小慧，王 梅（新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

骆驼蓬（Peganum hannal L．）系蒺藜科多年生草本植物，是新疆地区道地药材，已被列入维吾尔药卫生部药品标准维吾尔分册。去氢骆驼蓬碱（harmine，HM）是从骆驼蓬的种子中提取的主要生物碱，研究表明，HM具有抗菌、抗疟原虫、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤、抗诱变等一系列药理作用[1-6]。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是以生理相容的高熔点脂质为骨架材料，将药物包裹在类脂核中或吸附于纳米粒表面制成固体胶粒给药系统。固体脂质纳米粒能改善药物溶解性， 提高稳定性，具有靶向性的特点，进而达到提高药效的作用[7]。磁性固体脂质纳米粒（magnetic solid lipid nanoparticles，MSLN）做为一种靶向给药系统，是将磁纳米粒装载在固体脂质纳米粒中，在外加磁场的作用下，达到主动靶向 作用；本设计同时将药物与磁纳米粒装载在固体脂质纳米粒中，改善药物溶解性，提高稳定性，在外加磁场的作用下，药物被选择性的送到特定靶部位，使药物缓慢释放，减少药物剂量，降低对周围正常组织的损伤，提高了治疗效果[8-11]。因薄膜分散法制备的脂质纳米粒粒径小，包封率高，本研究选用薄膜分散法为制备方法，并通过星点设计其基质成分及工艺条件，以进一步提高制剂的质量，优化制备工艺。

1 仪器与试剂

AB135-S 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；UV2700 紫外可见分光光度仪（北京莱佰泰科仪器有限公司）；EYELAN-1100 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；Malvern Z3000 粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；离心机（德国赛默飞世尔科技有限公司）。

去氢骆驼蓬碱原料药（批号：442-51-3，含量≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；大豆卵磷脂（批号：20170715，药用级，上海蓝季科技有限公司）；单硬脂酸甘油酯（批号：20160912，上海山浦化工有限公司）；硬脂酸（美国Sigma公司）；山嵛酸甘油酯（批号：20170924，法国佳法赛公司）；泊洛沙姆188（批号：201 70524，山东西亚化学股份有限公司）；胆酸钠（上海麦克林生物科技有限公司）；Brij58（阿达玛斯试剂公司）；磁纳米粒（实验室自制）；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 HM-MSLN的包封率与载药量的测定方法

2.1.1 标准曲线的制作 精密称取1.0 mg HM于10 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，制备100.0 μg·mL-1的储备液。精密吸取储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10.0 mL容量瓶，甲醇定容，以浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.2 HM-MSLN 的包封率与载药量测定 包封率测定：将去氢骆驼蓬碱磁固体脂质纳米粒的混悬液置于EP管中，高速离心（4 ℃，转速15 000 r·m in-1，离心时间50 min），取上清液于10 mL容量瓶甲醇定容，在300 nm处测定游离药物吸光度，计算游离药物量。另取一定量的去氢骆驼蓬碱磁固体脂质纳米粒混悬液加适量甲醇破乳测定吸光度，计算总药物量。

包封率=（投药量 - 游离药物）/投药量×100%。

载药量测定：冷冻干燥法测定磁固体脂质纳米粒的载药量，方法为精密量取去氢骆驼蓬碱磁固体脂质纳米粒的混悬液1 mL于EP管中高速离心（4 ℃，转速15 000 r·min-1，离心时间50 min），取下层沉淀冷冻干燥，精密称定上一步冷冻干燥粉末1.0 mg用甲醇溶解测定吸光度，计算载药量。

载药量=包封于纳米粒中的药物量/磁纳米粒总质量×100%。

2.1.3 超速离心法和超滤离心法回收率试验[12]精密称取卵磷脂20.0 mg，硬脂酸60.0 mg于茄形瓶中加10 mL 乙醇超声溶解即为油相；精密称取泊洛沙姆20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg于烧杯中加20 mL超纯水超声溶解作为水相。将置于茄形瓶中的油相，以旋转蒸发仪真空浓缩（50 ℃，0.05 MPa）蒸干后得到油膜，将1.0 mg·mL-1泊洛沙姆水溶液加入茄形瓶中超声波清洗器超声40 min（100 W），既得空白MSLN混悬液。

超速离心：取0.5 mL 空白磁固体脂质纳米粒于EP管中，从100.0 μg·mL-1HM对照品储备液中分别取0.4、0.6、0.8 mL于上述含有0.5 mL空白脂质纳米粒中高速离心（4 ℃，转速15 000 r·min-1，离心时间50 min），取上清液于10 mL容量瓶甲醇定容至刻度，300 nm测定吸光度，计算加样回收率。

超滤离心：取0.5 mL空白磁固体脂质纳米粒于超滤离心管（截留量为10 kDa），从100.0 μg·mL-1HM对照品储备液中分别取0.4、0.6、0.8 mL于上述含有0.5 mL空白磁固体脂质纳米粒中高速离心（4 ℃，转速15 000 r·min-1，离心时间50 min），取下清液于10 mL容量瓶甲醇定容至刻度，300 nm测定吸光度，计算加样回收率。

2.2 制备方法的筛选和处方及工艺优化

2.2.1 制备方法筛选 采用薄膜超声分散法、乳化溶剂挥发法、乳化超声分散法、乳化低温固化法进行去氢骆驼蓬碱磁固体脂质纳米粒制备方法的筛选。

2.2.2 单因素考察 考察脂质材料、脂质材料与卵磷脂比、水相表面活性剂种类及质量浓度、脂质材料质量浓度、去氢骆驼蓬碱用量、超声时间、超声功率对包封率的影响。

2.2.3 星点设计优化[13-14]根据单因素试验结果，选择对结果影响较显著的3 个因素作为考察对象，即单硬脂酸甘油酯用量（X1），脂质材料与卵磷脂之比（X2），油相水相之比（X3），因素取值范围分别是X1为40 ～ 100 mg，X2为0.3 ～ 3；X3为0.3 ～ 2，以包封率（Y1）、载药量（Y2）、粒径（Y3）作为因变量（效应值），采用星点响应面法优化处方。采用三因素五水平星点设计，实验设计见表1。

表1 星点设计因素水平Tab 1 Factor level of star point design

3 结果

3.1 载药量和包封率测定方法的确定

所得标准曲线线性回归方程为：Y = 19.216 X - 1.685 5（r ＞ 0.999）。结果表明去氢骆驼蓬碱在2 ～ 12 μg·mL-1质量浓度范围内线性关系良好。超速离心法回收率试验得到低、中、高浓度（2、6、8 μg·mL-1）的加样回收率为100.4%、98.9%、98.5%，RSD 均小于2.0%。超滤离心法的加样回收率为85.6%、91.2%、90.08%，RSD不符合要求。因此超速离心法精密度、准确性良好，表明该方法可用于载药量及包封率的测定。

3.2 制备方法的筛选

取4种方法制得的HM-MSLN混悬液，按照前述方法测定包封率、粒径，实验结果见表2。结果表明，采用乳化溶剂挥发法、薄膜超声分散法制备的去氢骆驼蓬碱磁固体脂质纳米粒的包封率均在90%以上，而乳化低温固化法、微乳超声分散法的包封率分别为88.72%、73.52%；从粒径结果看，薄膜超声分散法所得混悬液的粒径最小。结合包封率和粒径两个因素综合考虑，乳化溶剂挥发法包封率最高，但有溶剂残留导致固体脂质纳米粒的包封药物降解，不适合工业化大生产等问题，所以最终选择薄膜超声分散法为HM-MSLN的制备方法。

表2 不同制备方法的HM-MSLN测定结果. n = 3Tab 2 Results of different preparation methods of HM-MSLN. n = 3

3.3 单因素考察

3.3.1 固体脂质材料选择 分别选用脂质材料为单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、山嵛酸用量均为60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，泊洛沙姆188用量为20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，去氢骆驼蓬碱5.0 mg按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，对其包封率进行考察。上述不同脂质材料用量的磁脂质纳米粒混悬液按“2.1.2”项下方法测定包封率。结果表明，以山嵛酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯为固体脂质纳米粒可形成包封率相对较高，稳定性较好的MSLN。但山嵛酸甘油酯和硬脂酸为脂质材料制备的磁固体脂质纳米粒有沉淀产生，不稳定。以单硬脂酸甘油酯为脂质材料制备的固体脂质纳米粒的包封率较高，无沉淀，稳定性较好，因此脂质材料选择单硬脂酸甘油酯。

3.3.2 脂质材料用量的选择 单硬脂酸含量分别选用40.0、50.0、60.0、80.0、100.0 mg，泊洛沙姆188 20.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，去氢骆驼蓬碱5.0 mg，按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封 率进行考察。单硬脂酸甘油酯用量为80 mg和100 mg磁脂质纳米粒有沉淀，而单硬脂酸甘油酯用量40 mg制备的磁脂质纳米粒均匀、稳定且包封率最高。

3.3.3 表面活性剂的选择 表面 活性剂分别为Brij58、胆酸钠、泊洛沙姆188，用量均为20.0 mg，硬脂酸60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，去氢骆驼蓬碱5.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。结果表明，Brij58制备的磁脂质纳米粒放置后有沉淀，而胆酸钠和泊洛沙姆188均无沉淀，稳定性较好，但泊洛沙姆188制备的磁脂质纳米粒包封率更高，因此最佳表面活性剂选择泊洛沙姆188。

3.3.4 泊洛沙姆188用量 精密称取泊洛沙姆188用量为5.0、10.0、20.0、30.0 mg，单硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，去氢骆驼蓬碱5.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。因20.0 mg和30.0 mg泊洛沙姆制备的磁性脂质纳米粒的包封率并没差别，故选择泊洛沙姆用量为20.0 mg。

3.3.5 去氢骆驼蓬碱用量 去氢骆驼蓬碱用量分别为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg，单硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg，按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。当去氢骆驼蓬碱的用量为30.0 mg和40.0 mg时，磁性脂质纳米粒有絮状物出现，10.0 mg和5.0 mg时包封率较为接近，所以选择去氢骆驼蓬碱用量为5.0 mg。

3.3.6 单硬脂酸甘油酯与卵磷脂的比例 单硬脂酸甘油酯与磷脂的比例以20∶60、30∶60、40∶60、60∶60、60∶40、60∶30、60∶20，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg，按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。星点设计阶段选择的药脂比为0.3 ～ 3。

3.3.7 油相与水相比例 有机相与水相的比例（v∶v）以30∶20、20∶20、20∶10、30∶10、20∶30、10∶30、10∶20，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。星点设计阶段选择的药脂比为0.3 ～ 2。

3.3.8 超声时间 制备HM-MSLN最后一步，分别采用超声10、40、60 min进行处理，去氢骆驼蓬碱用量为5.0 mg，单硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1. 0 mg，泊洛沙姆20.0 mg按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。由结 果可知超声时间对包封率并没有太大的影响，为了缩短制备时间，选择超声时间为10 min。

3.3.9 超声温度 超声时间10 min（冰浴/室温），去氢骆驼蓬碱用量5.0 mg，单硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg 按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。由结果可知超声温度对包封率并没有显著的影响，故超声温度选择室温。

3.3.10 超声功率 超声时间10 min，超声温度为室温，超声功率分别为40、60、100 W，去氢骆驼蓬碱用量5.0 mg，单硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁纳米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg按“2.1.3”项下方法制备磁性脂质纳米粒，按“2.1.2”项下方法对其包封率进行考察。由结果可知超声功率为60 W时包封率最高，故选择超声功率为60 W。

3.4 星点设计优化试验

3.4.1 星点设计试验结果 根据三因素五水平（表）制备不同处方的去氢骆驼蓬碱磁固体脂质纳米粒，测定粒径及载药量，实验结果见表3。

表3 星点设计试验结果Tab 3 Results of star point design test

3.4.2 模型拟合 采用Design-Expert 8.0软件对数据进行处理及效应面处方优化，分别以包封率（Y1）、载药量（Y2）和粒径（Y3）为因变量，以单硬脂酸甘油酯质量（X1）、单硬脂酸甘油酯与卵磷脂质量比（X2）、油水相之比（X3）为自变量进行模型拟合，结果表明各因变量与自变量以二项式方程拟合时相关系数（R）最大，Y1、Y2、Y3二项式拟合方程分别为Y1=+96.1-0.74

3.4.3 响应面分析 （1）对包封率的影响：单硬脂酸甘油酯的量，单硬脂酸甘油酯与卵磷脂之比对包封率都有显著的影响。随着脂 质含量增加，包封率呈现出逐渐增大至一个最大值，然后开始有下降的趋势。

（2）对载药量的影响：单硬脂酸甘油酯量，单硬脂酸甘油酯与卵磷脂之比，油水相之比对载药量有较显著的影响。随着脂质含量增加，载药量呈现先上升后下降的趋势。随着单硬脂酸甘油酯与卵磷脂之比的增大，载药量呈现增大的趋势。

（3）对粒径的影响：单硬脂酸甘油酯量，单硬脂酸甘油酯与卵磷脂之比，油水相之比对粒径有较显著的影响。随着脂质含量增加，粒径呈现先增大后变小的趋势。当脂质含量恒定时，药物粒径随油水相之比增大呈增大趋势。

3.4.4 优化与验证 以包封率、载药量最大为目的，用拟合方程预测最优条件。根据得到的最优处方X1（单硬脂酸甘油酯：85），X2（单硬脂酸甘油酯与卵磷脂比例：2.3），X3（油相水相比例：0.97），按照薄膜分散法制备HM-MSLN ，测定药物包封率和载药量，与预测值进行对比分析。由表4 可见，按照拟合得到的最优处方制备得到HM-MSLN的包封率和载药量，粒径接近，表明模型的拟合较好。

表4 最优处方的预测值与实测值Tab 4 Predicted and measured values of the optimal prescription

3.4.5 表征 室温下，取适量纳米粒悬浮液滴于覆盖碳膜的铜网上，2%磷钨酸复染，室温下干燥，投射电子显微镜观察纳米结晶形态，结果见图1，可知纳米粒呈圆形，分布均匀。用超纯水按适当比例稀释，激光粒度仪测定其粒径，测得平均粒径为162.7 nm，PDI为0.195。

4 讨论

图1 投射电镜图（×15 000）Fig 1 Transmission electron microscope image (×15 000)

本实验对4种HM-MSLN制备方法进行筛选，其中乳化低温固化法与微乳超声分散法的包封率低于乳化溶剂挥发法以及薄膜分散超声法，薄膜超声分散法与乳化溶剂挥发法包封率相近，但由于乳化溶剂挥发法容易导致有机溶剂残留情况，而薄膜超声分散法简单容易制备，所得固体脂质纳米粒稳定性较好，粒径较小，因此选择薄膜超声分散法为HM-MSLN的制备方法。山嵛酸甘油酯制备磁固体脂质纳米粒较其他脂质材料制备的磁固体脂质纳米粒稳定性差，容易沉淀。制备过程中山嵛酸甘油酯在乙醇中加热溶解（70 ℃），在50 ℃旋蒸温度下有析出现象，而且加热溶解过程中会使油相中的乙醇挥发，可能会对包封率有影响，所以选择稳定性好无沉淀的单硬脂酸甘油酯为脂质材料。本实验通过三因素五水平制备HMMSLN，所得实际制备结果与预测结果吻合性好，偏差小，因此本法所确定的制备HM-MSLN的最佳配比有一定的可行性，在今后的实验中可进一步探索HMMSLN的冷冻干燥制备工艺，旨为HM-MSLN确定可行的制剂种类提供理论参考。