王亚芳,张连彦,周艳飞,钟昆芮,王海军

(1.北京市兽药监察所,北京 大兴 102629;2.北京生泰尔科技股份有限公司,北京 大兴 102206)

板蓝根系十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根,为我国常用中药,具有清热解毒,凉血利咽的功效。在《中国兽药典》2015版二部[1]中,板蓝根质量标准收载了精氨酸的薄层鉴别方法,未建立含量测定方法。有文献[2]报道氨基酸类成分在板蓝根中是主要活性成分之一,具有一定的抗病毒作用;同时含量相对较多,也是可以区别南板蓝根的主要成分。从以往的文献[3]报道来看,精氨酸多采用氨基酸分析仪或采用衍生化法来进行测定,采用氨基酸分析仪测定时,样品处理复杂;衍生化法影响因素较多,在衍生过程中容易产生误差。因此我们建立了高效液相色谱法,针对精氨酸没有紫外吸收的特征,选择蒸发光散射检测器进行检测,方法简便、准确,适用于板蓝根的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪,Alltech 2000ES蒸发光散射检测器,DTL-500型超声波清洗机(北京德泰隆科技发展有限责任公司);超纯水机。试剂为三氟乙酸[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];水为自制高纯水。

板蓝根对照药材(中国食品药品检定研究院,批号121177-201608);板蓝根对照药材(中国兽医药品监察所,批号Z0291606);精氨酸(中国食品药品检定研究院,批号140685-201707,含量以C6H14N4O2计 99.9%)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱ZORBAX SB-Aq(5 μm,4.6×250 mm,Agilent公司),柱温30℃;水-三氟醋酸 (100∶0.2)为流动相,流速0.3 mL/min;漂移管温度110℃,载气流量：2.5 L/min。

2.2 对照品溶液的制备 取精氨酸对照品12.5 mg,精密称定,置25 mL量瓶中,加流动相使溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取2 mL,置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得0.1 mg/mL的精氨酸对照品溶液。见图1、2。

图2 精氨酸对照品色谱图(0.1 mg/mL,进样10 μL)

2.3 供试品溶液的制备 取通过3号筛的供试品粉末约0.5 g,精密称定,置具塞瓶中,精密加流动相50 mL,超声处理30 min,放至室温,滤过;精密量取续滤液2 mL,置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;过0.45 μm滤膜,作为供试品溶液。见图3。

图3 供试品色谱图

2.4 测定方法 分别吸取对照品溶液5 μL、10 μL及供试品溶液5～20 μL(使其峰面积在工作曲线内),注入液相色谱仪,将峰面积和进样质量取自然对数后用外标两点法计算供试品含量。

2.5 线性关系考察 在上述同样色谱条件下,分别精密吸取对照品溶液(0.10 mg/mL)2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL 注入色谱仪,测定峰面积。以峰面积的常用对数为横坐标,以精氨酸进样质量的常用对数为纵坐标,绘制标准曲线并计算回归方程S：log m=0.626 30·log A-2.290 56,R=0.999 6。 结果表明精氨酸在0.2 μg～1.6 μg范围内线性关系良好,见图4。

2.6 精密度试验 精密吸取供试品溶液,在上述同一色谱条件下,连续进样6次,测定精氨酸含量平均值4.55%,RSD值0.3%。

2.7 重复性试验 取同一批药材平行制备6份供试品溶液,在上述同一色谱条件下,测定精氨酸含量平均值4.52%,RSD值0.3%。

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液,在上述同一色谱条件下,在0时、4时、8时、12时、16时、34时分别进样,测定精氨酸含量平均值4.44%,RSD值0.9%。

2.9 回收率试验 采用加样回收法,取板蓝根粉末(含量4.52%),精密称定,分别精密加入精氨酸对照品,按上述色谱条件测定,计算回收率。结果见表1,色谱图见图5。

图4 精氨酸线性图

表1 板蓝根中精氨酸的加样回收试验

图5 添加回收样品色谱图

2.10 样品含量测定 按照上述方法,分别对11个不同的板蓝根药材中精氨酸进行含量测定。结果见表2。

3 小结与讨论

3.1 本试验分别采用水-三氟醋酸(100∶0.2),甲醇-水-三氟醋酸(2∶100∶0.2)作为流动相,经试验表明：以水-三氟醋酸(100∶0.2)为流动相被测组分与相邻组分分离较好,峰形对称,且精氨酸含量稳定性好。

3.2 本试验分别采用流动相、水、20%乙醇溶液、40%乙醇溶液作为溶剂,经试验,以流动相为溶剂时,精氨酸组分响应值较高且峰形良好,不随进样质量变化而改变峰形对称性。

3.3 试验发现温度对精氨酸含量测定有影响,随温度增加其峰面积减小,需要恒定柱温来保证数据的准确性。考虑室温要求为10℃ ～30℃,因此设置柱温为30℃,即满足室温规定,也确保数据测定条件一致。

表2 板蓝根中精氨酸含量测定结果

3.4 样品测定结果表明：各产地药材精氨酸含量有一定差异。其中河北产地平均含量为4.7%,略高于其他产地;从来源上看,同仁堂药材基地的板蓝根精氨酸含量较高;两个板蓝根对照药材精氨酸含量也较高。

3.5 同时测定了南板蓝根对照药材(来源：中国食品药品检定研究院,批号：1210971-201507)的精氨酸含量,结果未检出。因此,此方法也可以作为南北板蓝根鉴别的参考方法。