郝 杰 ，杨 茜，吴红红，张凯晔，贾小云，高志强，贺立恒

（山西农业大学农学院，山西 太谷 030801）

小麦是世界上种植最广泛的粮食作物，可以适应各种环境条件[1-2]，它为世界上大多数人口提供了蛋白质、能量以及矿物质营养。提高小麦的产量与品质是小麦生产的主要目标。施氮是提高小麦产量与蛋白质含量最有效的方法，也是最直接且快速提高小麦经济效益的措施[3]。因此，氮肥的有效利用在农艺、经济、环境方面起着至关重要的作用[4-5]。

人们常用增加氮肥的施用量来增加小麦产量。预计到2050年，世界人口将会增加到90 亿，如果按现在的栽培措施，当氮肥的施用量为原来的4 倍以上时，才能满足世界人口对粮食增产的需求[6-8]。然而小麦产量的增加与氮肥施用量并没有呈现出线性关系，在过去40 a 里，当氮肥使用量为原来的8 倍以上时，而粮食产量仅为原来的3 倍[9-10]。氮肥增施的报酬递减规律揭示出氮肥使用量的大幅度增加对全球可持续的粮食产量的提高作用逐渐降低，且过量施氮造成的氮肥流失正加剧全球生态系统内的氮污染，这已经成为威胁环境安全的重要因素之一，并导致生物多样性的减少与气候的变化[11]。前人利用15N 同位素示踪法进行田间小区试验，结果表明，我国旱地大田中氮素损失达20%以上[12]。

在前人的研究中，关于AMF（丛枝菌根菌）在提高其他植物氮素利用率方面已有研究报道。在大田条件下，小麦根系与AMF 也能够自然形成共生体系。祝英[13]通过盆栽大田试验对小麦接种光壁无梗囊霉（Acaulospora laevis）、根内球囊霉（Glomus intraradices）和单孢球囊霉（Glomus monosporum）3 种AMF 真菌，均能显著提高六倍体春小麦籽粒产量，改善产量构成因素，增加繁殖分配，改善R-V（繁殖与营养分配）指数，并显著提高收获指数。马放等[14]研究表明，在大田条件下，人工添加AMF 菌剂可显著提高AMF 对小麦的侵染率，同时，小麦株高与地上部生物量分别提高14.08%，24.05%。AMF 对宿主植物氮吸收的影响不但与菌根真菌自身的种类、根际伴生菌的种类和数量有关，也与外界氮源有关。朱晨[15]研究表明，不同施肥制度对土壤中菌根真菌多样性存在影响，然而不同作物不同土壤中驱动菌根真菌群落变化的主要因子却有差异。但是随着氮素投入增加，AMF 的多样性均下降。李晋荣等[16]研究不同施氮水平下AMF 真菌群落对三叶草生长的影响，结果表明，菌根真菌的侵染率随施氮水平的增高而降低，在高氮水平下，AMF 对植物营养的贡献率几乎为零，反而会抑制三叶草的生长。

早期关于AMF 在宿主植物吸收养分方面的研究较多，但并没有针对黄土高原特殊立地条件的研究报道，再加上研究方法的局限性，很大程度上限制了人们对黄土高原旱地土壤中AMF 群落结构的清晰认识，阻碍了AMF 共生体在旱地小麦生产中的挖掘应用潜力。不同施氮水平以及耕作措施对黄土高原AMF 菌群结构的影响作用尚未见报道。

本研究根据黄土高原这一特殊立地条件并结合主要粮食作物小麦，采用高通量测序技术，探索不同施氮条件下AMF 群落结构变化，为建立黄土高原旱地小麦基于菌根群落结构优化下的氮素高效利用的可持续高产高效栽培技术体系提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验区位于山西晋南旱作麦区试验基地，属典型暖温带大陆气候，四季分明，年平均气温12.6 ℃，年降雨量 500 mm 左右，7，8，9月降雨量较大，无霜期185 d，主要种植作物为小麦。试验地为夏闲地，黏壤土至粉砂质黏壤土，土壤基础肥力为：有机质8.65 g/kg，全氮 0.74 g/kg，碱解氮 32.93 mg/kg，速效磷2.08 mg/kg。

1.2 试验方法

试验共设3 个施氮水平，分别为：N1.0 kg/hm2；N2.90 kg/hm2；N3.180 kg/hm2。采用随机区组设计，重复3 次，共设置9 个小区，小区面积100 m2，所有处理均基施磷肥（P2O）590 kg/hm2、钾肥（K2O）90 kg/hm2，所有肥料均播前一次施入土壤。分别在越冬期（11月21日）、拔节期（3月21日）、开花期（5月6日）、成熟期（6月4日）4 个时期采集各施氮水平下0～100 cm 土层根系土样，分3 个土层：L1.0～20 cm；L2.20～60 cm；L3.60～100 cm。土样分别标记、装袋，将采集到的样品迅速置于4 ℃冰箱保存。

1.3 AMF多样性测定

各土层根际土壤及根系AMF 的多样性测定与分析，委托华大基因公司采用目前微生物多样性分析最为先进的技术——宏基因组测序方法完成。

1.4 土壤DNA提取

使用Power Soil DNA 分离试剂盒（MO BIO Laboratories）从样品中提取总DNA。DNA 质量和数量通过波长260 nm/280 nm 和260 nm/230 nm 的比率进行评估。

1.5 文库建库及高通量测序

提取小麦根系土壤样品总DNA 后，根据保守区设计引物并采用18s 定制引物，前引物序列AAGCTCGTAGTTGAATTTCG，后引物序列为CCCA ACTATCCCTATTAATCAT[17-19]，在末端加上测序接头后进行PCR 扩增。扩增步骤为：根据样品的实际扩增情况将样品统一稀释到20 ng/μL，不足的直接使用原液。扩增体系（25 μL）：5×反应缓冲液 5 μL，5×GC 缓冲液 5 μL，dNTP 原料（2.5 mmol/L）2 μL，前引物（10 μmol/L）1 μL，后引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL。 扩增参数为：预变性 98 ℃ 2 min，变性 98 ℃15 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，25～30 个循环，终延伸72 ℃5 min，10 ℃保存。扩增后对产物进行纯化定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。

1.6 生物信息学分析

根据双端测序序列（PE reads） 之间的重叠（Overlap）关系，将Hiseq 测序得到的双端序列数据拼接（Merge）成一条序列 Tags，同时对序列（Reads）的质量和Merge 的效果进行质控过滤。通过统计数据处理各阶段样品序列数目，评估数据质量。主要通过统计各阶段的序列数、序列长度、GC 含量、Q20和Q30 质量值、有效值（Effective）等参数对数据进行评估。在0.97 的相似度水平下，得到了每个样品的OTU 个数，然后根据样品中共有及特有的OTU数目绘制Venn 图，直观地表现出样品间的相似度。根据软件平台进行物种注释及分类学分析。使用Mothur（version v.1.30）软件，对样品 Alpha 多样性指数进行评估，以及对样品采用距离算法得到样品间的距离矩阵，通过R 语言工具进行Beta 多样性分析来衡量样品在时间、空间尺度上的物种组成变化，主要包括非度量多维标定法（NMDS）分析、非加权组平均法（UPGMA）分析、组间物种差异热图等。

2 结果与分析

2.1 稀释性曲线分析

稀释性曲线（Rarefaction Curve）是从样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列所代表的物种数目，并以序列数与物种数来构建曲线，用于验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，并间接反映样品中物种的丰富程度。

由图1可知，AMF 真菌样品的稀释曲线趋于平坦，不会随测序量增加而增长，已涵盖绝大多数的AMF 物种信息。

2.2 不同施氮处理下物种OTU多样性比较分析

从图2可以看出，N1，N2，N3处理下共有 OTU个数为 125 个，没有特有的 OTU，表明在 N1，N2，N3这3 种施氮水平下小麦根际土壤中AMF 群落组成相似度较高。

N1处理下，L1土层含有 123 个 OTU，L2土层含有 122 个 OUT，L1与 L2土层共有的 OTU 为 121 个，L1与 L3土层共有的 OUT 为 122 个，L2与 L3土层共有的 OUT 为 122 个，说明 L1与 L2土壤中 AMF 群落组成相似度低于L1与L3，L2与L3之间的相似度。

N2处理下，L1与 L2土层共有的 OTU 为 119 个，L1与 L3土层共有的 OTU 为 119 个，L2与 L3土层共有的 OTU 为 121 个，说明 L2与 L3土壤中 AMF 群落组成相似度较高。

N3处理下，L1与 L2土层共有的 OTU 为 120 个，L1与 L3土层共有的 OUT 为 123 个，L2与 L3土层共有的 OUT 为 119 个，说明 L1与 L3土壤中 AMF 群落组成相似度较高，L1与 L2次之，L2与 L3最低。

2.3 不同施氮处理下AMF多样性分布

物种组成分布柱状图可反映小麦不同生育时期根际A MF 不同分类学水平上的群落结构。图3～7 分别展示纲水平、目水平、科水平、属水平、种水平的群落结构和分类比较结果。从图3～7 可以看出，黄土高原旱地小麦在不同生育期不同土层的根际土壤中AMF 物种包括球囊菌门（Glomeromycota）3 纲、4 目、5 科、5 属、29 种，其中，类球囊属（Paraglomus）、球囊霉属（Glomus）、近明球囊霉属（Claroideoglomus）为优势属，sp._VTX00308 与 _sp._VTX00193 为优势种。

从图3可以看出，施氮对土壤中AMF 群落结构影响较大，其中发生主要变化的是球囊菌纲（Glomeromycetes）与类球囊菌纲（Paraglomeromycetes），二者约占总菌群的95%以上。N1处理下，L2土层类球囊菌纲（Paraglomeromycetes）较高，相对丰度占总菌群的70%左右；N2处理下，球囊菌纲（Glomeromycetes）较低，相对丰度占总菌群的30%左右；N3 处理下，随着土层深度增加，球囊菌纲（Glomeromycetes）呈逐渐降低，而类球囊菌纲（Paraglomeromycetes）呈逐渐增加。

从图4可以看出，AMF 在目分类水平下，发生主要变化的为类球囊菌目（Paraglomerales）与球囊霉目（Glomerales），相对丰度占到总菌群的95%以上，其变化趋势与其各自对应的纲水平变化相似。

从图5可以看出，N1处理下，L3土层相比于其他2 个土层球囊霉科（Glomeraceae）较高，占总菌群的15%左右，而类球囊霉科（Paraglomeraceae）在L2土层中分布较多，相对丰度占总菌群的70%左右；N2处理下，L2土层相比于其他2 个土层球囊霉科（Glomeraceae）较高，相对丰度占总菌群的25%左右，而类球囊霉科（Paraglomeraceae）在L3土层中分布较多，相对丰度占总菌群的70%左右；N3处理下，随着土层深度增加，类球囊霉科（Paraglomeraceae）逐渐降低，而类球囊菌纲（Paraglomeromycetes）逐渐增加，相对丰度占总菌群的45%左右。

由图6可知，AMF 在属分类水平下，不同处理下发生主要变化的是类球囊属（Paraglomus）、球囊霉属（Glomus）、近明球囊霉属（Claroideoglomus），其变化趋势与科水平上的变化趋势相似。

由图7可知，在种水平上，AMF 群落结构受不同施氮量的影响，其变化比较明显，含量较为丰富的优势菌种为sp._VTX00308 与_sp._VTX00193，二者总量占到总菌群的65%以上。

2.4 不同施氮处理Alpha多样性指数分析

使用 Mothur（version v.1.30）软件，对不同施氮量各土层样品进行聚类后的样品复杂性分析。衡量9 个样品的物种丰度（richness）及物种多样性（diveristy）有4个指标：Shannon，Simpson，Ace，Chao1。Chao1 和Ace 指数衡量物种丰度即物种数量的多少，Shannon 和Simpson 指数用于衡量物种多样性。

由表1可知，N2处理下，相比于对照（N1）与高氮（N3）处理，各土层的 Shannon 指数最大，Simpson指数最小，根际土壤AMF 多样性最高，这表明适宜的施氮量会提高土壤中AMF 多样性。

表1 不同施氮量各土层Alpha 多样性指数分析

N1处理下，L3土层的 Shannon 指数最大，Simpson 指数最小，这表明在L3土层根际土壤AMF 多样性较高，且L3土层的Chao1 和Ace 指数最大，其丰度也较高。

N2处理下，在L2土层的Shannon 指数最大，Simpson 指数最小，这表明在L2土层根际AMF 多样性较高；Chao1 和Ace 指数在L3土层均最大，根际土壤AMF 丰度较高。

N3处理下，Shannon 指数随着土层的加深逐渐增大，Simpson 指数随着土层的加深而逐渐减小，这表明随着土层的加深，小麦根际AMF 多样性呈逐渐增加的趋势；Chao1 和Ace 指数在L1土层最大，在L2土层最低，这表明L1土层根际土壤AMF 丰度较高，L2土层根际土壤AMF 丰度较低。

2.5 不同施氮处理Beta多样性分析

图8是对样品聚类分析后的样品热图，样品热图是基于距离算法得到样品间的距离矩阵，通过R语言工具绘制样品热图，可根据颜色梯度的变化直观看出两两样品间的差异性。从图8可以看出，N2L1与 N2L2，N2L3与 N1L2，N3L1与 N1L1这3组样品中AMF 菌群的相似度较高，N3L2与各样品的AMF 菌群的差异性较大。

UPGMA 聚类树与柱状图结合绘图是将聚类树与丰度柱状图结合起来展示的一种分析手段。图中左侧为样品聚类树（同UPGMA），用以判断各样品间物种组成的相似性；图右侧为各样品属水平的丰度柱状图，用以判断各样品间物种丰度的相似性。

由图9可知，N2L1 与 N3L2，N3L3与 N1L3，N3L1与N1L1这3 种处理组合下，样品的相似度较高，3 种处理下，样品中优势菌群为类球囊属（Paraglomus）、球囊霉属（Glomus）、近明球囊霉属（Claroideoglomus），N2L2与其他各样品差异较大，N2L2样品中球囊霉属（Glomus）相对丰度最高。

3 结论与讨论

AMF 作为一种共生真菌对小麦根系土壤中氮的固定、分布、形态结构等都产生了重要影响，施氮处理影响了小麦根际土壤AMF 菌群结构，进而影响了小麦植株氮素代谢。前人研究表明，农田中肥料的使用会影响AMF 群落结构，特别是氮肥的大量投入，改变了AMF 的种群组成[20-21]。土壤肥力包括速效磷、有机质含量等，对AMF 孢子的数量有很大影响。土壤pH 值变化会直接影响AMF 丰度及其多样性[22]。可见，通过一定的栽培技术措施间接地调节土壤肥力、水分和pH 值，能优化AMF 菌群结构[23]。本试验研究表明，施氮处理会显著影响根际AMF 菌群结构，且在适量氮肥施用（中氮，N2）处理下，小麦根际土壤AMF 多样性要高于对照（N1）与高氮（N3）处理，与前人在其他作物上的研究结果一致。张贵云等[24]研究表明，不同施氮水平对小麦AMF 群落结构的形成以及分布具有显著的影响，但随氮素投入增多，AMF 多样性下降。刘洋等[25]研究表明，适量的氮肥与磷、钾肥的配合施用，相比于不施肥处理显著增加了土壤中AMF 多样性，施入一定量的氮肥可显著增加菌根真菌系统的多样性。

黄土高原旱地小麦根际土壤AMF 物种组成丰富，不同施氮处理下，小麦根际土壤AMF 菌群结构组成不同。N2L1与 N3L2，N3L3与 N1L3，N3L1与 N1L1等3 种处理组合下，样品相似度较高，N2L2与其他样品差异较大，N2L2样品中球囊霉属（Glomus）相对丰度最高。刘佳[26]研究表明，不同施肥处理样地中根围土壤孢子数量在不同土壤深度也有差异。0～30 cm土层孢子数量明显多于30 cm 以下土层。郭辉娟等[27]研究表明，柠条根际AMF 菌丝定殖率及孢子密度在0～10 cm 土层达到最大值。本试验研究表明，对照（N1）与中氮（N2）处理下，小麦根际 AMF 丰度在L3土层达到最大值，N3处理下，随着土层的加深，小麦根际AMF 多样性呈逐渐增加的趋势，AMF丰度在L1土层达到最高，而其多样性没有表现出一致性规律，这可能与土壤中其他理化性状有关。

特别提出的是，土壤根际AMF 菌群结构以及其他微生物不仅受施氮等栽培技术措施的影响，还受自然条件等多方面因素制约，导致根际AMF 多样性研究呈复杂化趋势。试验在开始设计时考虑不同耕作制度对黄土高原旱地根际土壤中AMF 影响较大，为便于分析，选择其中的一种氮肥处理因子对样品进行分析，忽略了另外一些自然因素对AMF菌群结构的影响，给试验带来一定的误差。为了准确阐明其他栽培方式对根际土壤AMF 的分布特征的影响，还需要通过定点试验，结合其他栽培方式及土壤的理化性状进一步探索与研究，为建立基于菌群结构及其功能优化基础上的旱地绿色高效栽培技术提供理论支撑。