张培风，王长彪，赵兴华，刘 江，韩 斌，路贵和

（1.山西大学生物工程学院，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西 太原 030031）

玉米作为世界上重要的农作物之一，具有高产、稳产的特点[1]。随着工业和农业的快速发展，我国对玉米的需求量大幅增加[2]。玉米作为杂种优势效果最显著的作物，其主要的核心环节是如何快速获得优良的自交系[3]。目前，在育种领域快速选育自交系主要采用单倍体育种技术，只需1～2 个世代即可获得性状优良的纯系，而常规育种则需6～7 代，利用单倍体育种技术的优势，能够极大地提高育种效率[4]。玉米单倍体的倍增主要是通过自然加倍和化学加倍，但自然加倍率较低。据报道，最高的自然加倍率也仅有5%[5]，达不到加倍的理想状态，因此，大多数研究者主要采用化学加倍方法，利用秋水仙素加倍试剂可以大大提高加倍效率。研究表明，不同的秋水仙素处理浓度、处理时间和处理部位，加倍效率大不相同[6-7]。但在加倍过程中往往会出现秋水仙素毒性污染、实验操作流程复杂、成本较高、受客观条件限制等问题，因此，急需探索一种低毒高效、操作简便、加倍效率高的加倍方法。

目前，育种界玉米单倍体加倍方法主要采用浸种法、浸根法、切芽法、注射法及组培法等。GAYEN等[8]采用浸种法，对单倍体种子用不同质量分数的秋水仙素进行不同时间的浸泡处理，结果表明，单倍体种子在0.06%的秋水仙素中浸泡12 h 加倍效果最佳，加倍成功的种子占18%。文科等[9]采用浸根法，当玉米种子发芽到5～7 cm 时，将其幼根浸泡至秋水仙素溶液中，结果表明，0.02%的秋水仙素为最佳。刘海等[10]通过对处于芽苗期内玉米单倍体喷施秋水仙素，不同浓度处理下散粉率最高的可达42.5%。CHASE[11]于1952年采用0.05%的秋水仙素溶液对玉米单倍体盾片节进行注射，研究表明，经处理的单倍体结实率是对照组的4 倍多。陈宝健等[12]通过幼胚组培的方法研究表明，不同浓度甲酰胺草磷处理的单倍体雄穗散粉效果存在明显差异，其中，1 μmol/L 处理 72 h 的成株散粉率可达37.0%。

本试验结合前人浸种法的研究，通过对玉米单倍体胚部划胚的方法，用不同质量分数的秋水仙素和不同处理时间进行加倍处理，对玉米单倍体的加倍效率进行研究，以期开辟一条高效率、操作简便的单倍体加倍的新技术途径，从而为单倍体育种提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为以玉米自交系TX3-2 和DK516 组配的杂交种为母本、诱导系TY1 为父本进行诱导后挑选出的单倍体种子。加倍试剂为二甲基亚砜和秋水仙素，均来自于Solarbio 试剂公司，其中，秋水仙素纯度为98%。所有材料均种植于山西省农业科学院位于海南省的南繁试验基地和山西省农业科学院东阳试验基地。

1.2 试验方法

1.2.1 种子的划胚处理 将筛选出的单倍体种子用流水冲洗干净，放置于灭菌培养皿中，用清水浸泡，置于28 ℃培养箱内，24 h 后将处于萌动状态的玉米籽粒取出，用滤纸滤干水分，使用消毒后的刀片在种子胚芽部表层轻划2～3 mm。全程操作需戴一次性消毒手套及口罩。

1.2.2 秋水仙素处理 将划胚后的单倍体种子和对照组（经24 h 清水浸泡后未划胚的单倍体种子）分别放置在质量分数为0，0.04%，0.06%，0.08%，0.12%的秋水仙素溶液中，分别处理3，6 h。

1.2.3 处理后的清洗 将秋水仙素处理后的单倍体进行流水清洗1～2 h，沥干后移至试验田。

1.2.4 田间观察及记录 将处理过的单倍体种子单粒播种于田间，观察并记录各处理的出苗率、成活率、散粉率和结实率。以单倍体加倍后的散粉情况来判断玉米单倍体是否加倍。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 划胚处理对玉米单倍体加倍效率的影响

从表1可以看出，划胚处理下玉米单倍体加倍后植株的出苗率和成活率受到影响，其平均值均低于不划胚处理的植株；但植株的散粉率和结实率均显著增加，其散粉率和结实率平均分别为19.17%，9.17%，明显高于不划胚加倍处理（5.63%，2.09%）。

表1 划胚处理对玉米单倍体加倍效率的影响

从表2，3，4，5可以看出，划胚处理对玉米单倍体加倍后植株的出苗率、散粉率、结实率的影响与不划胚处理间差异均达显著水平（P＜0.05），对成活率的影响差异达极显著水平（P＜0.01）。可见，玉米单倍体胚部划胚处理能够显著地提高玉米单倍体的散粉率和结实率。

表2 划胚处理对玉米单倍体加倍后出苗率的方差分析

表3 划胚处理对玉米单倍体加倍后成活率的方差分析

表4 划胚处理对玉米单倍体加倍后散粉率的方差分析

表5 划胚处理对玉米单倍体加倍后结实率的方差分析

2.2 不同质量分数的秋水仙素对划胚后玉米单倍体加倍效果的影响

从表6可以看出，在划胚和不同质量分数秋水仙素加倍条件下，玉米单倍体加倍后植株的出苗率、成活率、散粉率和结实率均有不同程度的提高（0.08%秋水仙素处理除外），其中，0.04%秋水仙素处理的植株出苗率、成活率、散粉率和结实率均最高，分别为44.17%，36.67%，17.09%和9.59%；随着秋水仙素质量分数的不断增加，玉米植株的出苗率、成活率、散粉率和结实率都有下降趋势。由此说明，秋水仙素质量分数越高，对植株的生长影响越大，在秋水仙素质量分数为0.04%的加倍处理条件下，对玉米单倍体加倍后的植株伤害最小，加倍效果较明显。

2.3 秋水仙素不同处理时间对划胚后玉米单倍体加倍效果的影响

玉米单倍体加倍后植株的散粉率可以用来判断单倍体加倍效果，其散粉率越高，代表加倍效果越好。由图1可知，玉米单倍体加倍后的植株散粉率随着秋水仙素质量分数的增高而降低，当加倍处理在同一秋水仙素质量分数下，加倍3 h 植株的散粉率高于加倍6 h 的植株散粉率，其中，秋水仙素质量分数为0.04%、加倍时间为3 h 时植株散粉率最高，可达17.09%。由此可得，选择合适质量分数的秋水仙素和处理时间能够通过划胚后植株的散粉率表现出最佳的加倍效果，其中，当秋水仙素质量分数为0.04%、加倍时间为3 h 时植株的散粉率最高，加倍效果最好。

3 结论与讨论

秋水仙素可以有效提高单倍体的加倍效率，早在1955年，SEANEY[13]采用浸泡法用秋水仙素对玉米单倍体的幼苗根部进行处理，结果发现，只有2株植株散粉，加倍效果较差。GAYEN 等[14]研究表明，用0.05%秋水仙素对玉米单倍体根部浸泡24 h，单倍体材料加倍效果最好。刘志增等[15]采用注射法分别对处于6 叶期和拔节期的玉米单倍体进行注射，结果表明，秋水仙素为0.05%和0.01%的玉米单倍体散粉率较高，加倍效果较好。刘俊等[16]用0.06%的秋水仙素溶液和2%的DMSO 分别采用浸根法、滴注心叶和针刺生长点法对单倍体进行处理，结果表明，加倍效果最好的是针刺生长点法，平均加倍率可以达到23%。惠国强等[17]采用不同质量分数的除草剂对6 叶期幼苗滴心法处理，结果表明，利用80 μmol/L的甲基胺草磷处理加倍效果最佳，平均加倍率可达23.32%。范志青[18]用0.06%的秋水仙素溶液对玉米幼胚处理24 h，加倍效率最高。谢琦[19]采用组培技术对玉米单倍体幼胚进行加倍，结果发现，在光照为2 000 lx，温度在26 ℃时幼胚快速显色；当秋水仙素为0.04%、处理24 h 时加倍效果最好。李浩川等[20]采用不同质量分数的秋水仙素对玉米单倍体成熟胚进行加倍处理，结果表明，用0.005%质量分数的秋水仙素处理24 h 加倍效果最佳，综合效率可达57.61%。杜文平等[21]对玉米单倍体幼芽切根进行处理，其中取根长5～10 mm，秋水仙素为0.06%和0.2%的二甲基亚枫处理加倍效果最佳，散粉率和结实率分别达51.39%和8.74%。本试验通过对玉米成熟籽粒划胚进行加倍处理，与前人通过浸泡、滴心、针刺及幼苗成熟胚组培方法相比较，可以简便流程，不受人员和时间限制，并得到了理想的加倍效果。在利用秋水仙素加倍过程中，要做好防毒工作，秋水仙素是白色或黄色粉末，无味，属剧毒物质，3～13 mg 就会导致人体窒息死亡[22]，因此，在实验完毕后应做好秋水仙素废液处理，从而降低秋水仙素对人体和环境的污染。

本研究中，通过对玉米单倍体成熟籽粒胚部划胚，并结合不同质量分数的秋水仙素及不同处理时间对玉米单倍体进行加倍，结果表明，玉米单倍体胚部划胚处理显著高于自然加倍；当秋水仙素质量分数为0.04%、处理3 h 时，秋水仙素对植株的伤害最小，散粉率最高，达17.09%，加倍效果最好。这可能是因为籽粒胚部生长点处于分生组织区，细胞分裂快，当受到轻微损伤后在秋水仙素处理下，刺激更加明显，导致加倍效率增加。本研究为单倍体加倍开辟了一条新的技术途径，通过不断地完善能够为玉米双单倍体工程化和规模化提供技术基础。