陈霁晖，顾芬芬，李 超，林志燕，黄晓会，刘 艳

上海交通大学医学院附属新华医院 药学部，上海 200092

乳腺癌是继肺癌之后全球发病率最高的肿瘤，也是导致女性患癌死亡最重要的原因[1]。乳腺癌的发病率逐年升高，我国2014年女性乳腺癌新发病例约27.89万例，占女性恶性肿瘤发病的16.51%，居女性恶性肿瘤发病率首位[2]。目前乳腺癌的治疗以手术方式为主，但术后的抗肿瘤化疗也非常重要。临床上的化疗药物众多，其作用机制和效果不尽相同，其中铂类药物是抗癌药物中重要的一类，现已用于乳腺癌、尤其是三阴乳腺癌患者的化疗。由于人体间的个体差异以及肿瘤细胞普遍对化疗药物产生的耐药现象，均会影响药物的疗效，因此在体外对抗癌药物进行筛选非常有意义。MTT法作为一种检测药物对肿瘤细胞增殖影响的方法，是目前肿瘤患者体外药物药敏性筛选的常规方法之一[3]。

三磷酸腺苷结合盒 （ATP-binding cassette，ABC）跨膜转运蛋白超家族异常表达，是肿瘤细胞耐药性形成的重要原因，也是目前逆转肿瘤细胞耐药的研究焦点。ABC跨膜转运体家族的一些成员可以利用ATP水解产生的能量，将化疗药物转运到细胞外，降低细胞内的药物浓度，减弱化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，导致细胞耐药性的产生。其中与肿瘤耐药最密切相关也是研究最多是：ABCB1（multidrug resistance 1，MDR1/P-gp/PGY1）、ABCG2（breast cancer resistance protein，BCRP）以及 ABCC家族中的9种多药耐药相关蛋白 （multidrug resistance protein，MRPs）[4，5]。

本文采用MTT法对人乳腺癌样本进行体外药物敏感性试验，通过检测3种铂类药物 （顺铂、卡铂、奥沙利铂）对肿瘤细胞体外增殖的影响，测定药物对肿瘤细胞的抑制率。结合肿瘤细胞的11种与耐药密切相关的ABC跨膜转运蛋白的基因表达水平，研究耐药转运蛋白基因表达水平与肿瘤细胞对铂类药物耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 标本

取2014年4月～2015年12月就诊于本院的34例乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，术后标本均经病理证实为乳腺癌。患者均为女性，年龄33～79岁，中位年龄59岁。所有患者均为首次治疗，术前未化疗。标本于无菌条件下浸于生理盐水中、并快速送至无菌实验室。

1.2 肿瘤细胞悬液制备

取肿瘤组织标本，用RPMI-1640培养液 （含10%小牛血清和青霉素 100 U·mL-1、链霉素 100 μg·mL-1）反复冲洗，剪除脂肪、纤维及坏死组织，选取边缘生长好、无坏死的肿瘤组织小块，无菌剪刀剪成糊状，然后将剪碎的组织和细胞培养液倒入筛孔内径（150±6.6）μm 的不锈钢筛中，研磨、过滤，制成细胞悬液。将细胞悬液离心 10 min（1 500 r·min-1），用培养液清洗2次。离心后用细胞计数板在显微镜下计数，用培养液调整细胞浓度约5×105个/mL。

1.3 MTT药物敏感试验

采用96孔板培养，设3组：用药组、对照组、空白组。用药组中每孔加入铂类药物10 μL（顺铂：1.00mg·mL-1，卡铂：0.50mg·mL-1，奥沙利铂：0.24mg·mL-1）和细胞悬液 90 μL。每组药物设 3 个复孔，药物终浓度等于药物1次快速静脉注射后理论最高血药浓度；对照组不加药，加入细胞悬液90 μL；空白组不加药，加入培养液90 μL。将加完样的96孔板置于培养箱中37℃、5%CO2条件下培养48 h。每孔中分别加 5 mg·mL-1MTT 20 μL， 继续培养 4 h。每孔加10%SDS 100 μL溶解沉淀并终止反应。16～18 h后用酶标仪在570 nm（630 nm参比波长）波长处检测光密度值（吸光度值A）。取3复孔的吸光度平均值作为细胞在此药物组的平均吸光度值。

肿瘤细胞抑制率 （%）=（对照组吸光度值-用药组平均吸光度值）/（对照孔平均吸光度值-空白组吸光度值）×100%；判断标准：肿瘤细胞抑制率>30%为敏感；<30%为耐药。

1.4 实时荧光定量PCR法测定肿瘤组织ABC跨膜转运蛋白基因的表达水平

肿瘤细胞的总RNA提取采用Invitrogen公司的 TRIZOL reagent kit；cDNA逆转录采用 Applied Biosystem公司的High Capacity cDNA Archive Kit；qRT-PCR采用 Bio-Rad公司的 MyiQTM Single-Color Real-Time PCR Detection System和AB science公司的HotStart-IT SYBR Green One-Step qRT-PCR Master Mix Kits。以18S rRNA的表达为内标；基因的mRNA表达水平表示为2-△△CT。

1.5 统计学方法

所有数据均经SPSS24.0软件处理，基因表达水平以均数±标准差）表示，采用t检验做两组间差异显著性分析，spearman秩相关性分析做两变量间的相关性分析，r绝对值大于0.5视为有较强的相关程度。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 体外药敏试验结果与ABC跨膜转运蛋白基因表达的关系

检测的11种与肿瘤耐药相关的ABC跨膜转运蛋白、在34例乳腺癌患者肿瘤细胞中的表达如下（×10-3/18S rRNA）：ABCB1：5.51±0.95；ABCG2：132.6±20.8；ABCC1：5.50±1.38；ABCC2：2.40±0.46；ABCC3：16.4 ±2.59；ABCC4：8.58 ±2.11；ABCC5：27.6 ±4.31；ABCC6：5.65±1.65；ABCC10：3.24±1.09；ABCC11：2.39±0.53；ABCC12：13.8±3.55。3 种铂类药物对 34 例乳腺癌患者肿瘤细胞的平均抑制率为：顺铂：43.35%；卡铂：38.87%；奥沙利铂：40.52%。

表1 体外药敏试验敏感组与耐药组中ABC跨膜转运蛋白基因表达水平比较（×10-3/18S rRNA）

如表1所示，ABCB1的mRNA含量在顺铂、卡铂耐药组明显高于敏感组，ABCG2的mRNA含量在顺铂耐药组明显高于敏感组，差异均有统计学意义（P<0.05）。其余基因表达高低在铂类药物敏感组与耐药组之间无显著差异。

2.2 乳腺癌组织中ABC跨膜转运蛋白基因表达水平与铂类药物体外抑制率的关系

在乳腺癌组织中，ABC跨膜转运蛋白基因表达水平与铂类药物体外抑制率的关系见表2。

从表2发现，顺铂对乳腺癌细胞的抑制率与ABCB1（r=-0.51，P<0.01）和 ABCC6（r=-0.55，P<0.01）的表达水平有明显相关性，且相关程度较强。与ABCG2（r=-0.49，P<0.01）、ABCC5（r=-0.41，P<0.05）、ABCG11（r=-0.38，P<0.05）和 ABCC12（r=-0.36，P<0.05）的表达也呈显著负相关。其中ABCB1的表达水平与顺铂对肿瘤的抑制率关系见图1-A；ABCC6的表达水平与顺铂对肿瘤的抑制率关系见图1-B。

表2 ABC跨膜转运蛋白基因表达水平与顺铂、卡铂、奥沙利铂对肿瘤组织抑制率的相关性分析（n=34）

2.3 乳腺癌组织中ABC跨膜转运蛋白基因表达水平与卡铂体外抑制率的关系

如表2所示，发现卡铂对乳腺癌细胞的抑制率与 ABCB1（r=-0.51，P<0.01）的表达水平有明显相关性，且相关程度较强。与 ABCC1（r=-0.35，P<0.05）和ABCC6（r=-0.46，P<0.05）的表达也呈显著负相关。ABCB1的表达水平与卡铂对肿瘤的抑制率关系见图1-C。

2.4 乳腺癌组织中ABC跨膜转运蛋白基因表达水平与奥沙利铂体外抑制率的关系

如表2所示，发现奥沙利铂对乳腺癌细胞的抑制率与ABC跨膜转运蛋白的基因表达水平均无明显相关性。

图1 ABCB1的表达水平与顺铂对肿瘤组织抑制率的关系（A）、ABC C6的表达水平与顺铂对肿瘤组织抑制率的关系（B）和ABCB1的表达水平与卡铂对肿瘤组织抑制率的关系（C）

3 讨 论

随着研究的深入，人们对乳腺癌的认识不断加深，治疗手段日益增多。不过目前手术治疗仍是乳腺癌首选的治疗方式，但是化疗作为乳腺癌术后必不可少的一种辅助治疗，对于乳腺癌的根治以及降低复发率都有着重要的作用。由于肿瘤存在一定的异质性，不同个体之间的差异以及药物代谢酶、药物转运酶等基因的多态性和表达差异，导致个体对肿瘤药物的敏感性也有很大的差异。因此研究不同个体肿瘤的生物学特性及对化疗药物的敏感性差异具有重要的实用价值。MTT法是一种成熟、简便、快捷、灵敏的体外测定药物敏感性的方法。本研究采用MTT法分析了34例乳腺癌患者的肿瘤细胞对3种铂类药物（顺铂、卡铂、奥沙利铂）的敏感性，发现肿瘤患者间存在着明显的个体差异。同时，检测了肿瘤细胞的11种与耐药密切相关的ABC跨膜转运蛋白的基因表达水平，结合其MTT的药敏结果，分析研究耐药转运蛋白表达水平与肿瘤细胞对铂类药物耐药的关系。

目前研究发现，在人类中至少有48种ABC跨膜转运蛋白，其中多种参与了肿瘤细胞多药耐药的形成。在ABC跨膜转运体家族中，ABCB1、ABCG2以及ABCC家族中9种多药耐药相关蛋白（MRPs）是与肿瘤多药耐药最密切的ABC跨膜转运蛋白[4，5]。ABCB1是一种与耐药有关的细胞膜糖蛋白，生理状态下其能够将机体的毒素和外源性物质转运出细胞，起到保护作用。在许多血液系统肿瘤和实体肿瘤中，如乳腺癌、口腔上皮麟癌、卵巢癌等，ABCB1原发性过表达。过表达的ABCB1转运体主动将肿瘤细胞内的化疗药物泵出，使肿瘤细胞内化疗药物蓄积减少，从而产生耐药[6，7]。有研究发现，乳腺癌患者化疗后，ABCB1阳性的患者对化疗反应较差，5年生存率明显降低[8]。本研究发现，ABCB1在乳腺癌顺铂和卡铂的敏感组和耐药组之间的表达水平均有统计学差异，且在乳腺癌组织中ABCB1基因表达水平与顺铂、卡铂对肿瘤细胞的体外抑制率呈现负相关，说明ABCB1的高表达会导致乳腺癌细胞对顺铂、卡铂的耐药。

ABCG2最早在多柔比星耐药的乳腺癌细胞系中被发现，因此也称作乳腺癌耐药蛋白。其同样具有药物排出泵功能[9]，过表达可以导致多种肿瘤细胞对化疗药物如铂类、蒽环类药物的耐药[10，11]。本研究显示，ABCG2在乳腺癌细胞中高表达，其在敏感组和耐药组之间的表达水平有统计学差异，且基因表达水平与顺铂对肿瘤细胞的体外抑制率呈现负相关，说明ABCG2的高表达会导致乳腺癌细胞对顺铂的耐药。而在卡铂或奥沙利铂给药组中，没有观察到类似的相关性。

ABCC蛋白家族是由ABCC基因编码的，目前已发现了13种ABCC家族的成员，其中9种与药物耐药性有关，命名为 MRP1～MRP9：ABCC1（MRP1）、ABCC2 （MRP2）、ABCC3 （MRP3）、ABCC4（MRP4）、ABCC5 （MRP5）、ABCC6 （MRP6）、ABCC10（MRP7）、ABCC11（MRP8）、ABCC12（MRP9）。MRPs蛋白依靠ATP供能，转运内源性物质或抗肿瘤药物，使得胞内药物的有效浓度降低，从而导致肿瘤细胞耐药。目前研究发现，MRP家族的成员介导多种肿瘤细胞对化疗药物耐药[12]。其中ABCC6最早是在表阿霉素耐药的人白血病细胞中发现的[13]。其在肝脏和肾脏中高表达，但在其他各种组织中也有表达。在体外实验中发现，中国仓鼠卵巢细胞过表达ABCC6会对顺铂、依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素等抗肿瘤药物耐药，但其在临床肿瘤耐药中的研究较少[14]。本研究发现，在9种MRP家族成员中，ABCC5、ABCC6、ABCC11和ABCC12的基因表达水平与顺铂对肿瘤细胞的体外抑制率呈现负相关，其中ABCC6与抑制率的负相关程度最大，说明MRP家族的多个蛋白高表达都有可能会导致乳腺癌细胞对顺铂的耐药。对于卡铂而言，ABCC1和ABCC6的表达水平与其对肿瘤细胞的抑制率也有负相关性。而MRP家族成员的表达都没有发现与奥沙利铂耐药有显著相关性。

在3种铂类药物中，顺铂的分子量最小、结构最简单，而奥沙利铂的结构最复杂，药物结构上的差别可能导致了转运体对其作用的差异。

总之，本研究发现，在ABC跨膜转运蛋白家族中，多个蛋白的高表达与顺铂、卡铂的耐药有关，其中ABCB1的高表达与药物耐药的关系最为显著。针对这些靶点的新药物的研发，有望提高乳腺癌的化疗效果。本文是基于34例乳腺癌患者的研究结果，今后还需扩大样本量或增加药物种类作进一步的研究。