朱明明，高天怡，徐志珍，周佳祺，李俊雯，陈珏，张文清，*

（1.华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237；2.上海市嘉定区农业技术推广服务中心，上海201800）

罗汉菜（Thlaspi arvense Linn）为双子叶植物纲十字花科菥蓂属一年生草本植物，学名菥蓂，别名遏蓝菜、苏败酱、败酱草、苦芥子、野榆树、大芥、瓜子草和菥目等[1]，在我国各地都有分布，其菜籽可治疗风湿性关节炎、腰痛、急性结膜炎和胃痛等症状[2]。

黄酮（flavonoids）是一类具有1，3-二苯基丙烷或1，2-二苯基丙烷结构的含氧杂环天然有机化合物。随着近年来研究的不断完善与深入，黄酮在抗菌、抗肿瘤和抗氧化等方面表现出了显著活性[3-8]，引起了学者们的广泛关注。

国内涉及到罗汉菜籽化学成分研究的报道较少，并且多以黑芥子苷和多糖为主[9-11]。因此，探究罗汉菜籽总黄酮的提取纯化及其体外抗氧化活性研究，对于综合开发利用罗汉菜这一宝贵植物资源具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗汉菜籽采摘自上海嘉定区农业技术推广服务中心；芦丁标准品、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：阿拉丁试剂公司；1，1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：麦克林试剂公司；2-2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）：阿达玛斯试剂公司；抗坏血酸：国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

R-201 旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；DKS24 电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；SHZ-D 循环水式真空泵：上海予华仪器有限公司；WKZ-4 粉碎机：青州市精诚医药装备制造有限公司；FD1 冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司；CH-8606 微量分析天平：瑞士Mettler Toledo 公司；UV-2550 紫外可见分光光度计：日本Shimadu 公司；Flash A 中压制备色谱系统：苏州汇通色谱分离纯化有限公司；Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Agilent 1100 高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；SinoChrom ODS-BP 制备色谱柱（10 μm）：依利特有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 罗汉菜籽原料预处理

罗汉菜籽去除杂质，浮选去除品质较差的种籽，干燥后粉碎并过40 目筛；用石油醚（沸程为30 ℃～60 ℃）浸泡过夜，去除菜籽中的油脂，然后将罗汉菜籽烘干备用。

1.3.2 罗汉菜籽总黄酮提取工艺优化

称量5.0 g 预处理过后的罗汉菜籽，放置于圆底烧瓶中，安装好回流提取装置。根据陈飞等[12]探究的单因素试验条件，并做出改进，按照一定条件（乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数）提取罗汉菜籽中的总黄酮，对应的正交试验因素水平表和正交试验表如表1和表2，回流结束后将提取液浓缩，并定容于10 mL容量瓶中，进行含量测定。

表1 总黄酮提取正交试验因素水平表Table 1 Parameters of orthogonal experiment on extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

表2 总黄酮提取正交试验表Table 2 Orthogonal experiments on extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

1.3.3 黄酮标准曲线的制作

采用紫外分光光度法和芦丁标准曲线测定并计算总黄酮含量[13]。用移液枪移取0.2 mg/mL 芦丁标液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 于6 只25 mL 比色管中，加70%乙醇至总体积为5.0 mL，加1.0 mL 5%的亚硝酸钠，摇匀并放置6 min，加1.0 mL 10%硝酸铝，摇匀并放置6 min，加10.0 mL 4%氢氧化钠，加蒸馏水至刻度并摇匀，放置15 min。以芦丁试剂空白作为参比液，在510 nm 波长处测定吸光度，以芦丁浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 黄酮含量测定

用移液枪移取1.0 mL 粗提液于25 mL 比色管中，按照1.3.3 的方法测定黄酮含量。

1.3.5 制备色谱纯化罗汉菜籽总黄酮

采用Flash A 中压制备色谱系统，色谱柱为SinoChrom ODS-BP 10 μm。称取2.0 g 黄酮粗提物，用50 mL 30%甲醇水溶解，高速离心机在1 000 r/min 的转速下离心10 min，离心结束后取上清液上样。系统中设定洗脱溶剂为0.1%乙酸水（A）∶甲醇（B）=70 ∶30（体积比），流速为10 mL/min，收集目标组分，收集完毕后更换洗脱溶剂为纯甲醇并清洗色谱柱，将收集到的组分浓缩后冷干，即得到纯化后的罗汉菜籽总黄酮。

1.3.6 罗汉菜籽总黄酮对DPPH 自由基清除能力测定

配制不同浓度的样品溶液，取1.0 mL 并加入1.0 mL 40 μg/mL 的DPPH 甲醇溶液，充分混匀，在室温下避光反应30 min，在517 nm 波长处测定吸光度，以未加入样品的DPPH 甲醇溶液作为空白参比，以BHT 为阳性对照，清除率的计算公式如下：

式中：A0为空白对照的吸光度；A为样品溶液的吸光度。

1.3.7 罗汉菜籽总黄酮对ABTS+自由基清除能力测定

配制7 mmol/L 的ABTS+二铵盐水溶液和4.9 mmol/L的过硫酸钾水溶液，等体积混合并在暗处反应16 h，即得ABTS+工作液。配制不同浓度的样品溶液，取1.0 mL样品溶液，然后加入2.0 mL ABTS+工作液，剧烈震荡后在暗处常温静置10 min，以无水甲醇为参比液，BHT的甲醇溶液为阳性对照，在734 nm 波长处测定吸光度，清除率计算公式见公式（1）。

1.3.8 罗汉菜籽总黄酮铁还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）的测定

配制pH值为3.5 的醋酸盐缓冲溶液，10 mmol/L的TPTZ 溶液和20 mmol/L 的FeCl3溶液，以10 ∶1 ∶1的体积比均匀混合上述3 种溶液即得FRAP 工作液。配制不同浓度的FeSO4溶液，各取100 μL 并用FRAP工作液定容至5.0 mL，37 ℃水浴加热20 min，在539 nm波长处测定吸光度，建立FeSO4标准曲线。配制一定浓度的样品溶液，用FRAP 工作液定容至5.0 mL，37 ℃水浴加热20 min，以抗坏血酸的水溶液作为阳性对照，在539 nm 波长处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 罗汉菜籽总黄酮提取工艺优化

2.1.1 芦丁标准曲线

以芦丁为对照品，采用紫外分光光度计，及A（lNO）33-NaNO2-NaOH 显色法对罗汉菜籽提取液中总黄酮含量进行测定。图1 是芦丁标准曲线图，线性回归方程为Y=0.013 7X-0.001 9（其中Y为吸光度；X为芦丁浓度，μg/mL），R2=0.999 4，n=5。该图说明在芦丁浓度为3.2 μg/mL～16.0 μg/mL 范围内线性良好。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.1.2 罗汉菜籽总黄酮提取工艺优化

有机溶剂萃取法提取罗汉菜籽黄酮黄酮正交试验结果见表3。采用正交试验法探究罗汉菜籽总黄酮的最优提取工艺，由表3的极差分析结果可知，各因素对罗汉菜籽总黄酮含量的影响程度各不相同，主次顺序为A＞D＞B＞C，即乙醇体积分数对总黄酮含量的影响最大，其次是提取次数，而提取时间影响最小。从该表中可知最优提取条件为乙醇体积浓度60 %，料液比1 ∶30（g/mL），提取时间75 min，提取次数3 次，测得的总黄酮含量为7.75 mg/g。但从提高生产效率的角度考虑，确定最终的提取条件为乙醇浓度为60%，料液比1 ∶30（g/mL），提取时间75 min，提取次数2 次。

表3 有机溶剂萃取法提取罗汉菜籽黄酮黄酮正交试验结果Table 3 Results of the orthogonal experiment on organic solvent extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

因此在该最终条件下进行3 次重复性试验，结果见表4。

表4 有机溶剂萃取法提取罗汉菜籽黄酮重复性试验Table 4 Results on the repeatability verification experiment of the extraction of flavonoids from Thlaspi Arvense Linn seeds

由表4可知，3 次重复试验的相对标准偏差（RSD）值为1.94%，重复性良好，且总黄酮含量较高。

2.2 制备色谱纯化罗汉菜籽总黄酮

通过Flash A 中压制备色谱系统，得到纯化后的总黄酮，样品外观为淡黄色不定型粉末。采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 显色法对纯化后的总黄酮进行含量测定，测得黄酮含量为563.8 mg/g。纯化前后总黄酮成分的高效液相色谱图见图2。

图2 罗汉菜籽总黄酮纯化前后的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatography of flavonoids from Thlapsi Arvense Linn seeds before and after purification by preparative chromatography

由图2可以看出纯化后的总黄酮在5 min～9 min范围内杂峰几乎消失，表明纯化效果良好。

2.3 罗汉菜籽总黄酮体外抗氧化活性研究

2.3.1 对DPPH 自由基清除能力测定

BHT、总黄酮粗提物和总黄酮纯化物对DPPH 自由基的清除效果见图3～图5，以半数抑制浓度（IC50）为评价标准，IC50越小，说明对DPPH 自由基的清除效果越好。BHT、总黄酮纯化物和粗提物对DPPH 自由基的清除率可达70%，半数抑制浓度（IC50）分别为10.25、18.50 μg/mL 和103.00 μg/mL。

图3 BHT 对DPPH 自由基的清除效果Fig.3 Scavenging activity of BHT on DPPH free radicals

图4 纯化后总黄酮对DPPH 自由基的清除效果Fig.4 Scavenging activity of purified flavonoids on DPPH free radicals

图5 总黄酮粗提物对DPPH 自由基的清除效果Fig.5 Scavenging activity of crude flavonoids on DPPH free radicals

由图3～图5可知在相同时间和DPPH 自由基总数下，BHT 的清除效果最好，粗提物的清除效果最差，但经制备色谱纯化后的总黄酮可显著提升对DPPH 自由基的清除效果。

2.3.2 对ABTS+自由基清除能力测定

BHT、总黄酮粗提物和总黄酮纯化物对ABTS+自由基的清除效果见图6～图8。

图6 BHT 对ABTS+自由基的清除效果Fig.6 Scavenging activity of BHT on ABTS+free radicals

图7 纯化后总黄酮对ABTS+自由基的清除效果Fig.7 Scavenging activity of purified flavonoids on ABTS+free radicals

图8 总黄酮粗提物对ABTS+自由基的清除效果Fig.8 Scavenging activity of crude flavonoids on ABTS+free radicals

由结果可知，BHT、黄酮纯化物和粗提物，对ABTS+自由基的清除率都达到了75 %以上，半数抑制浓度（IC50）分别为7、41、80 μg/mL。由图可知BHT 对ABTS+自由基的清除速度更快，并且效果远远优于黄酮纯化物和粗提物。然而，对黄酮粗提物进行纯化，可以显著提升其对ABTS+自由基的清除效果。

2.3.3 铁还原能力（FRAP）的测定

建立了浓度范围为0～120 mmol/L 的FeSO4浓度标准曲线，见图9。

图9 FRAP 试验标准曲线Fig.9 Standard curve of the FRAP experiment

Fe2+-TPTZ 的浓度与吸光度呈现较好的线性关系，线性方程为Y=0.021 4X+0.151 9，R2=0.999 5，n=11。在相同的测试条件下，将反应后的抗坏血酸对照溶液、总黄酮粗提物和纯化后样品溶液的吸光度值代入标准曲线，可得到FeSO4的当量浓度，即样品的抗氧化活性以达到同样吸光度值所需的FeSO4浓度（微摩尔数），其浓度越大，则抗氧化活性越强。经计算得知，抗坏血酸样液为1 424.82 μmol/（L·mg），黄酮纯化物为169.10 μmol/（L·mg），黄酮粗提物为54.09 μmol/（L·mg）。抗坏血酸的抗氧化活性远高于纯化黄酮和黄酮粗提物，但是纯化后的黄酮抗氧化活性显著升高。

3 结论

目前对罗汉菜籽的研究报道多数侧重于黑芥子甙，少有对黄酮的分离纯化研究。本文采用正交试验法优化了总黄酮提取工艺，最终确定提取条件为：乙醇浓度为60%，料液比1 ∶30（g/mL），提取时间75 min，提取次数2 次。采用制备色谱对粗提物中的总黄酮进行纯化，色谱条件为：上样量约10 mL，流动相为0.1%乙酸水：甲醇（体积比）=70 ∶30，流速为10 mL/min。在该条件下，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 显色法对制备色谱纯化后的黄酮含量进行测定，黄酮含量由10.0 mg/g提升至563.8 mg/g。

本文还对总黄酮粗提物和纯化产物进行抗氧化活性测定，包括对DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力的测定，以及对铁还原能力的测定，醇体系以BHT作为对照，水体系以抗坏血酸作为对照。结果表明，将黄酮进行纯化，其抗氧化活性显著提升，但是无论是纯化黄酮还是黄酮粗提物，抗氧化效果都略逊于BHT 和抗坏血酸。