陈雪，刘金福，2，*，张业尼，魏雅楠

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

南瓜多糖（pumpkin polysaccharide，PP）是南瓜中的主要活性成分，它可以清除机体在代谢过程中产生的羟自由基（-OH）[1]，具有降低胆固醇、保护视力、防癌、抗癌等作用，是理想的保健食品原料[2]。人参皂苷Rg1 是人参有效成份之一，也是鉴定人参的主要成份之一。它具有促智、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和提高免疫力等作用[3-4]。南瓜多糖和人参皂苷Rg1 分子结构有本质的区别，分子量大小不一，都具有抗氧化活性，有研究证明，南瓜多糖、普洱茶褐素、葛根黄酮提取物两两联合可增加Nrf2 蛋白及其下游抗氧化蛋白HO-1 的表达，从而可以更好地发挥其抗氧化作用，保障机体正常代谢[5]。原人参三醇（protopanaxatriol，PPT）与Rb1 或Rg1 的联合具有协同抗氧化活性，能协同提高抗氧化应答元件（antioxidant response element，ARE）活性、促进Nrf2 蛋白和mRNA 的表达，调节Nrf2-ARE通路介导的抗氧化途径[6]。将两种或以上活性成分联合使用，往往可以起到联合增效作用。本试验在建立氧化应激细胞模型的基础上，研究南瓜多糖与人参皂苷Rg1 的单一作用效果，以及将这两种物质联合使用，对细胞活力和不同抗氧化指标进行测定，探讨两种物质在抗氧化方面的联合作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南瓜多糖：天津农学院食品科学与生物工程学院实验室自制（纯度92.5%）；人参皂苷Rg1（纯度98%）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）、RIPA裂解液（RIPA lysis buffer）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）：北京索莱宝科技有限公司；清洁型昆明种雄性小鼠（24 g～26 g）、基础饲料：北京军事医学科学院实验动物中心；过氧化氢（分析纯）；北方天医化学试剂厂生产；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 实验仪器

紫外-可见分光光度计（722 型）：上海菁华科技仪器有限公司；全自动酶标仪（Bio-Tek ELX800 型）：美国宝特公司；立式压力蒸汽灭菌器（BXM-30R 型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电热恒温水浴锅（HWS28 型）：上海一恒科学仪器有限公司；CO2细胞培养箱（3111 型）：美国Thermo Forma 公司；超净工作台（SW-OJ-2FD 型）：苏州安泰空气技术有限公司；台式低速离心机（TD5A-WS 型）：湘仪公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肝细胞氧化应激损伤模型的建立与分组

1.3.1.1 肝细胞氧化应激损伤模型的建立

取雄性小鼠，将其断颈致死，置于超净台上，用碘酒轻轻擦拭腹部，解剖取肝脏，置于冰中，整个操作需无菌污染；将肝脏用无菌PBS 冲洗3 次；将肝脏剪成大约1 cm3大小，无菌PBS 溶液冲洗3 次，经200 目筛得细胞悬液，600 r/min 离心10 min，弃上清，沉淀物加培养液吹打混匀，800 r/min 离心10 min，洗涤两次。用血球计数板测定细胞活率及细胞密度。用培养液将细胞密度调整为5×106/mL，肝细胞活力大于90%。将上述肝细胞悬液于37 ℃，5%CO2培养箱中培养12 h 后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。建立氧化应激模型时，细胞存活率通常在50%～70%范围内[7-8]。若细胞的存活率过高，无法造成明显的氧化损伤，而细胞存活率过低，则引起不可逆损伤，均不利于构建氧化应激模型。当400 μmol/L 的H2O2继续培养12 h 时，细胞存活率为61.2%，故选择400 μmol/L 的H2O2作为最佳诱导浓度。

1.3.1.2 肝细胞氧化应激损伤模型的分组

取上述贴壁生长的肝细胞，分别设为正常组（NG），H2O2模型组（MG），浓度分别为0.333、0.667 mg/mL 和1 mg/mL 3 个剂量的南瓜多糖组（PP），分别为PP-1，PP-2，PP-3；和人参皂苷Rg1 组（Rg1），分别为Rg1-1，Rg1-2，Rg1-3；以及南瓜多糖与人参皂苷的联合组（JG），分别为JG-1，JG-2，JG-3；每组3 个平行，置于6 孔板中，分别加入H2O2400 μmol/L，继续培养12 h。

1.3.2 细胞活性检测

MTT 法测定细胞活性。

1.3.3 指标的测定

各孔加入500 μL 含有PMSF（苯甲基磺酰氟）的裂解液冰浴裂解10 min，收集裂解液，4 ℃下12 000 r/min，离心10 min，取上清液，采用试剂盒分别测定MDA、GSH-Px、SOD 和CAT 的含量。

1.3.4 统计分析

数据采用SPSS24.0 统计学软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（±S）表示，组间比较采用单因素方差分析，p<0.05 表示差异显著，p<0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 PP、Rg1、JG对细胞活性的影响

PP、Rg1、JG 对细胞活性的影响如图1所示。

由图1可以看出，小鼠肝细胞受H2O2刺激后，经MTT 法检测出的吸光度值明显降低，说明细胞活力降低，而添加PP、Rg1 及JG 可以不同程度地缓解氧化损伤，细胞活力增强。

与模型组相比，添加PP-1 后，细胞活力升高，与PP-2 差异并不显著，但是显著高于MG（p＜0.05），而PP-3 的细胞活力升高，并且明显高于MG（p＜0.05）。Rg1-1 与模型组差异不显著（p＞0.05），Rg1-2、Rg1-3的细胞活力显著高于MG（p＜0.05）。JG-1 浓度下，细胞活力与PP-1 没有显著性差异，但是显著高于MG 与Rg1-1（p＜0.05）；JG-2 的细胞活力升高，与PP-3 差异不显著（p＞0.05）；而JG-3 的细胞活力与MG 有极显著差异（p＜0.01），接近于NG。

实验发现PP、Rg1 与JG 浓度越高，细胞活力越高，具有量效关系。同浓度下，JG 与同浓度的单一作用相比，细胞活力效果最佳，表现出了良好的联合增效作用。

2.2 PP、 Rg1、JG对细胞模型MDA 含量的影响

PP、Rg1、JG 对细胞模型MDA 含量如图2所示。

图2 南瓜多糖和人参皂苷及其联合对细胞模型MDA 的影响Fig.2 Effect of pumpkin polysaccharide and ginsenoside and their combination on the cell model MDA

细胞脂质过氧化程度可以用丙二醛（MDA）水平来表示。图2显示，正常小鼠肝细胞培养液中MDA 含量为（0.314 1±0.015 0）nmol/mgHb，经H2O2刺激后，MDA含量为（8.962 1±0.099 1）nmol/mgHb，显著升高（p＜0.05），说明肝细胞受到氧化应激损伤。

加入PP 与Rg1 的细胞其MDA 水平显著下降（p＜0.05），并具有显著的量效关系，表明二者均能在一定程度上减轻细胞内的脂质过氧化，保护细胞对抗氧化应激状态；当PP 与Rg1 联合使用时，细胞的MDA水平较MG 显著降低（p＜0.01），与单一成分作用相比，JG 细胞的MDA 水平均显著低于同浓度的单一处理组（p＜0.05），呈现出良好的联合增效作用。

2.3 PP、Rg1、JG对细胞模型GSH-PX 活力的影响

PP、Rg1、JG 对细胞模型GSH-PX活力影响如图3所示。

图3 南瓜多糖和人参皂苷及其联合对细胞模型GSH-Px 的影响Fig.3 Effect of pumpkin polysaccharide and ginsenoside on cell model GSH-Px

如图3显示，添加PP 的细胞其GSH-Px 活性显著上升（p＜0.05），随着浓度增大活力逐渐增强，但PP-1与PP-2 的差异并不显著；而PP-3 显著高于MG（p＜0.05），Rg1 的GSH-PX 活性显著上升（p＜0.05），量效关系显著；当联合使用时，JG-3 细胞的GSH-PX 活性较MG 显著增强（p＜0.01），剂量效应关系显著，且JG 细胞的GSH-PX活性均显著高于同浓度下的单一作用组（p＜0.05），具有联合增效作用。

2.4 PP、Rg1、JG对细胞模型SOD 活力的影响

PP、Rg1、JG 对细胞模型SOD 活力影响如图4所示。

图4 南瓜多糖和人参皂苷及其联合对细胞模型SOD 的影响Fig.4 Effect of pumpkin polysaccharide and ginsenoside on cell model SOD

图4显示，添加PP 的细胞其SOD 活性显著升高（p＜0.05），随着浓度增大活力逐渐增强，但PP-1 活力低于MG，而PP-2、PP-3 显著高于模型组（p＜0.05）；Rg1-2、Rg1-3 的SOD 活性显著上升（p＜0.05），Rg1-1活力低于MG，与PP-1 差异不显著；联合作用时，JG-1与MG 差异不显著，但JG-2、JG-3 细胞的SOD 活性较MG 比显著增强（p＜0.05），具有明显的剂量效应关系，且JG-3 较模型组有极显著差异（p＜0.01）。与单一作用相比，JG 细胞的SOD 活性均显著强于同浓度的单一作用组（p＜0.05），同样表明二者具有联合增效作用。

2.5 PP、Rg1、JG对细胞模型CAT 活力的影响

PP、Rg1、JG 对细胞模型CAT 活力的影响如图5所示。

图5 南瓜多糖和人参皂苷及其联合对细胞模型CAT 的影响Fig.5 Effects of pumpkin polysaccharide and ginsenoside and its combination on cell model CAT

图5显示，PP-2、PP-3、Rg1-2、Rg1-3 处理的细胞其CAT 活性显著上升（p＜0.05），随着浓度增大活力逐渐增强；当联合作用时，JG-3 细胞的CAT 活性较模型组比显著增强（p＜0.01），并具有显著的剂量效应关系，JG 细胞的CAT 活性均显著强于同浓度的单一作用组（p＜0.05），联合增效明显。

3 讨论

本实验应用H2O2诱导小鼠肝细胞，H2O2可直接进入细胞内与各种细胞成分相互作用，产生氧化应激现象。有研究发现，南瓜多糖与人参皂苷均具有一定的清除自由基能力，并且能够起到抑制细胞凋亡，提高细胞活力和生理功能等作用[9-10]。H2O2在肝细胞内也会转变为（-OH），可引发膜脂质过氧化链式反应，双链脂肪酸过氧化（聚合）致MDA 增多，从而致使肝细胞膜通透性增加[10-12]。H2O2也可以使GSH-Px 等抗氧化酶活性水平下降，细胞损伤加重。对细胞氧化还原系统中抗氧化酶活性的提高能力常被用作考察抗氧化剂细胞保护能力的关键指标[13]。

本实验采用MTT 法检测细胞活性，选择MDA、GSH-Px、SOD、CAT 等作为评价肝细胞氧化损伤和改善修复的指标。实验设计不同浓度的PP 和Rg1 组对发生氧化应激的细胞进行干预，发现细胞活力增强，可以降低肝细胞内的MDA 含量，GSH-Px、SOD、CAT 活性升高，表现出良好的量效关系，但在相同的浓度下，表现的强弱有所差别，可能作用靶点和反应的通路有所不同。为了考察分子量和分子结构差异较大的多糖和皂苷两种物质的联合使用的抗氧化效果，实验设计了与单一物质相同浓度的联合组（JG），结果发现，随着浓度的增加，效果增强，同样表现出良好的量效关系，而且同浓度下的JG 在细胞活力和实验的各项抗氧化指标上效果更好，表现出明显的联合增效现象，可能通过不同靶点和通路的协同联动机制发挥作用。

4 结论

南瓜多糖与人参皂苷以及它们的联合使用均能显著提高H2O2诱导的氧化应激细胞的活力，能显著降低细胞MDA 水平，减轻细胞脂质过氧化损伤，通过提高细胞SOD、GSH-Px 和CAT 的活性，表现出良好的抗氧化活性，改善细胞氧化应激损伤。两种物质联合使用效果更加明显，起到了联合增效作用。