王 震

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 511400)

L-精氨酸是一种重要的半必需氨基酸，在有机体中参与刺激分泌，促进伤口愈合和一氧化氮的合成等多种生化过程，在食品、医药和保健行业有着广泛的应用[1]。L-精氨酸的生产方法主要有化学催化、蛋白水解和微生物发酵，其中微生物发酵是生产L-精氨酸的主要方法[2]。在过去20年中，利用微生物发酵生产L-精氨酸的方法得到了深入的研究，包括基于基因工程和代谢工程的L-精氨酸工程菌株的构建和发酵工艺优化[3-4]。

谷氨酸棒状杆菌作为L-精氨酸生产的主要菌类[5]，是一种革兰氏阳性菌，符合食品生产安全，可用于工业发酵生产谷氨酸，然而大部分野生型谷氨酸棒状杆菌都不具备积累L-精氨酸的能力[6]。在之前的工作中，以野生ATCC14067菌株为基础，利用基因工程得到了一株具有L-精氨酸生产潜力的菌ATCC14067-SG(简写为SG)，SG通过替换强启动子Peftu过表达了argGH、argC和icd基因，argB基因的268位组氨酸突变为谷氨酸，并把carA基因的起始密码子突变成ATG，odhA基因的起始密码子突变为GTG。在利用3 L发酵罐评价SG菌株的L-精氨酸积累能力时，发现L-精氨酸的积累产量较低，且伴随着大量副产物的积累。L-精氨酸的发酵过程是一个需氧的过程，溶氧水平的高低不仅关乎菌体的生长繁殖速度，对于代谢产物的积累也具有不可忽略的影响[7]。在1993年，Dominguez等[8]发现，当溶氧不足时，谷氨酸棒状杆菌ATCC17965会积累大量有机酸，如乙酸、琥珀酸和乳酸。为了减少代谢副产物的积累，提高L-精氨酸产量，笔者研究了5%、20%和35%这3种溶氧水平下，谷氨酸棒状杆菌SG的生长与代谢变化，确定了最适合谷氨酸棒状杆菌发酵积累L-精氨酸的溶氧方案。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。菌株为前期工作所构建的基因工程菌株SG(基于ATCC14067野生菌株，通过基因改造手段获得)，华南理工大学酶学与酶工程实验室保种。

1.1.2试剂。脑心浸液，购自美国BD公司；琼脂、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母浸膏、NaCl、尿素、K2HPO4、MgSO4、(NH4)2SO4、NaHCO3、乙酸钠等试剂购自广州普博仪器(纽普诺博生物制品)有限公司；2，4-二硝基氟苯和乙腈购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3培养基。BHI固体平板：脑心浸液37 g/L，琼脂20 g/L；BHI培养基：脑心浸液37 g/L；种子培养基：葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母浸膏10 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素2 g/L；发酵培养基：葡萄糖80 g/L，大豆蛋白胨2 g/L，硫酸铵3.75 g/L，尿素10.25 g/L，MOPS 42 g/L，磷酸二氢钾3.1 g/L，磷酸氢二钾0.4 g/L，七水硫酸镁0.375 g/L，七水硫酸铁52 mg/L，氯化钙14 mg/L，一水硫酸锰30 mg/L，七水硫酸锌0.8 mg/L，无水硫酸铜1.96 mg/L，一水氯化镍0.164 mg/L，生物素1.84 mg/L，PCA 295 mg/L，其中葡萄糖和尿素单独灭菌；补料培养基：葡萄糖500 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，(NH4)2SO420 g/L，其中葡萄糖单独灭菌。

1.2发酵参数控制

1.2.1菌落划线，活化及转接。将实验室保存的SG菌株在BHI固体培养基上划线，30 ℃恒温培养36 h。挑取单菌落接种至BHI培养基，30 ℃，250 r/min培养12 h。之后转接至种子培养基，起始OD600控制在0.2左右，30 ℃，250 r/min培养36 h。之后接种至装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，接种量以起始OD600等于0.5来计算。

1.2.2发酵参数控制。温度控制在30 ℃，硫酸铵调控pH稳定在6.8，溶氧调控分为高中低3个水平，分别为35%、20%和5%(固定通气量为2 L/min，通过调节转数来维持溶氧)。30 h之后以4.5 mL/h的恒定速率补充补料培养基，每6 h取样。

1.3检测方法

1.3.1生长检测。用OD600表示菌体生长，取发酵液利用UV2350型紫外分光光度仪，在波长600 nm处检测吸光值。

1.3.2残糖检测。利用SBA-40E生物传感分析仪测定残糖。

1.3.3氨基酸检测。氨基酸的测定依据DNFB衍生法[9]。将菌液离心取上清，样品稀释5倍，之后取稀释后的液体150 μL，加入pH 9.07、0.5 moL/L的NaHCO3150 μL，再加入DNFB溶液(准确吸取1 mL 2，4-二硝基氟苯，用乙腈定容到100 mL)150 μL，混匀，在暗处60 ℃水浴反应1 h，反应完成后暗处冷却至室温，加入1 050 μL pH 7.0的PBS缓冲溶液，暗处静置10 min，然后14 000 r/min离心10 min以去除杂质，最后用有机滤膜过滤转移至进样瓶。标准氨基酸溶液的处理同上。流动相A溶液为0.05 mol/L的乙酸钠溶液。称取无水乙酸钠4.1 g，加入超纯水990 mL，调节pH至6.8，再加入N，N-二甲基甲酰胺10 mL，有机滤膜过滤，然后超声30 min排除气泡。流动相B溶液是乙腈与水按55∶45的体积比配制，流速1 mL/min，检测温度30 ℃，检测波长360 nm。液相型号为waters e2695，UV检测器型号为Waters 2489，色谱柱为购自广州菲罗门的Gemini NX C18(5 μm × 250 mm)。

1.3.4乳酸检测。乳酸检测利用液相色谱法。发酵液离心取上清，用2.5 mmol/L的H2SO4稀释3倍，并用无机滤膜过滤。乳酸标准液处理如上。流动相为2.5 mmol/L的H2SO4，流速为0.6 mL/min，柱温为55 ℃，进样量10 μL，检测器为示差折光检测器。色谱柱为Carbomix H-NP10，购自苏州赛分科技有限公司。

2 结果与分析

2.1不同溶氧条件对SG生长和L-精氨酸积累的影响谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-精氨酸是一个需氧的过程，氧气的供应对于谷氨酸棒状杆菌的生长和代谢都有显著的影响。发酵过程中的温度和pH如图1a、b所示。为了防止发酵后期营养物质的不足，在发酵进行到30 h时，以4.5 ml/h的恒定速率补充补料培养基(图2a)。3种溶氧水平下的溶氧控制、SG的生长和L-精氨酸积累如图2b、2c和2d所示，在3种溶氧水平下，SG的生长趋势基本一致，其中20%溶氧水平的最高OD600要略高于5%溶氧和35%溶氧，且在发酵到达最高OD600之后，菌株的生长波动比较平稳，说明在发酵的中后期，20%的溶氧有助于保持正常的生理和代谢活性。

L-精氨酸的积累曲线显示，20%溶氧水平下，SG的L-精氨酸积累要明显优于35%溶氧和5%溶氧，在48 h时20%溶氧的L-精氨酸积累达6.38 g/L，为35%溶氧水平的117.28%，5%溶氧水平的140.53%。

图1 谷氨酸棒状杆菌SG发酵生产L-精氨酸的参数控制Fig.1 The fermentation parameter control of Corynebacterium glutamicum SG producting L-arginine

图2 谷氨酸棒状杆菌SG发酵生产L-精氨酸的溶氧、生长、耗糖及精氨酸积累曲线Fig.2 The DO，growth，sugar consumption and arginine accumulation curve of C. glutamicum SG producting L-arginine

2.2相关氨基酸和有机酸的代谢变化为了探究L-精氨酸差异的原因，分析了3种溶氧条件下SG的氨基酸和有机酸代谢变化，图3是谷氨酸棒状杆菌中精氨酸的代谢流程简图，图4(a～f)是谷氨酸棒状杆菌代谢途径中，产量差异较大的6种杂酸的积累曲线。3种溶氧水平中，5%溶氧时6种杂酸的积累都为最高；在20%和35%这2种溶氧水平下，鸟氨酸、赖氨酸和乳酸的积累基本保持一致，而对于谷氨酸和丙氨酸，35%溶氧下的积累会更高。

在谷氨酸棒状杆菌中，乳酸和丙氨酸同属于丙酮酸的代谢产物，而丙酮酸是连接糖酵解途径和TCA循环的关键节点[10]。乳酸和丙氨酸产量的提高会导致谷氨酸棒状杆菌的TCA循环活力减弱，而赖氨酸合成的增加会进一步分流TCA循环中流向精氨酸的可利用碳源和能量。谷氨酸和鸟氨酸是L-精氨酸的代谢前提物质，其产量的增加表明谷氨酸转化为L-精氨酸的代谢通路受阻[11]。

综合以上分析，可以推断出5%溶氧条件下TCA的代谢减弱，草酰乙酸的代谢产物赖氨酸合成增加，同时谷氨酸转化为鸟氨酸以及鸟氨酸转化为精氨酸的代谢通路受阻导致精氨酸的产量很低。35%溶氧条件下，虽然赖氨酸积累显著减少，鸟氨酸转化为L-精氨酸的通路正常，但丙氨酸和谷氨酸的积累仍然较高。20%溶氧条件下，丙氨酸、乳酸、赖氨酸和鸟氨酸的积累都维持在非常低的水平，而谷氨酸虽然积累较多，但相比较其他2种溶氧水平，已经有了明显改善，因此，20%的溶氧条件最适合SG发酵生产L-精氨酸。

图3 谷氨酸棒状杆菌中L-精氨酸的代谢流程Fig.3 The metabolic process of L-arginine in C. glutamicum

图4 谷氨酸棒状杆菌SG发酵生产L-精氨酸的杂酸积累分析Fig.4 Analysis of the accumulation of by-products in L-arginine produced by C. glutamicum SG fermentation

3 结论

该试验通过控制温度、pH等，改变溶氧的发酵条件，探讨了谷氨酸棒状杆菌SG发酵生产精氨酸的生长与代谢规律，发现20%溶氧条件下，菌体在整个发酵过程中不会受到代谢副产物的积累而影响菌体正常的生理和代谢活性，菌体在发酵后期的生长会更稳定，有利于发酵产物的积累。且20%溶氧下，菌体发酵产生的副产物最少，碳源和能源可以更多地用于L-精氨酸的合成，因此L-精氨酸积累最多，得出结论：20%溶氧最适合于精氨酸的发酵生产。该试验确定谷氨酸棒状杆菌发酵过程中溶氧的控制策略，建立了基因工程菌株产酸能力的评价体系，对精氨酸的实际工业发酵生产具有参考价值。