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(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

乳酸菌的表层蛋白(Surface layer protein,S-layer protein/SLP),又称S-层蛋白,指通过非共价作用,连接于多数细菌和古生菌的细胞壁和细胞膜最外层的蛋白结构[1-2]。乳杆菌的表层蛋白在已知的表层蛋白中是最小的一类,相对分子质量处于25～71 kDa之间,占细胞蛋白总量的 10%～15%,等电点普遍呈弱碱性[3]。但并非所有乳杆菌都具有表层蛋白结构,已知携带表层蛋白的乳杆菌有L.acidophilus、L.helveticus、L.brevis、L.crispatus、L.kefir、L.buchneri、L.parakefir、L.gasseri等。目前,对L.acidophilus的表层蛋白研究最广泛且较深入。

关于SLP结合到细胞外基质(ECM)蛋白并黏附到肠上皮细胞的直接实验证据己在L.acidophilusNCFM的SlpA蛋白[4-5]、L.capillarisJCM5810的CbsA蛋白[6]、L.crispatusZJ001中的SlpB蛋白[7]和L.brevisATCC8187的SlpA[8]蛋白中证实。但是对于SLP具体哪一段氨基酸序列会参与ECM组分的黏附,有研究表明L.crispatusJCM5810 CbsA蛋白N端位置31-274处的氨基酸残基是与鸡结肠胶原蛋白结合所必需的结构域[9]。L.brevisATCC 8287的S-层蛋白SlpA介导了菌体细胞与人结肠癌上皮细胞系和纤连蛋白的结合,并且SlpA N末端的81个氨基酸就足以与上皮细胞结合[10]。

表层蛋白对酸菌发挥益生功能也有着卓著的贡献。SLP除了作为黏附因子介导乳杆菌黏附定殖于肠道上细胞或ECM蛋白,以延长其在肠道中发挥益生作用的时间和保护菌体之外。还有助于乳杆菌抑制病原菌对肠道组织的感染,减少致病菌对肠道的细胞伤害,以及调节免疫的功能[5]。L.acidophilusATCC 4356 的SLP可以结合特异性抗原DC-SIGN,调节免疫反应,抑制胡宁病毒引起的细胞损伤[11]。

分离自新疆发酵酸马奶的L.acidophilusKLDS1.0901具有良好的耐酸、耐碱盐特性,能抑制致病菌的生长,改善腹泻[12]。本实验从体外探究了L.acidophilusKLDS1.0901的菌体浓度、生长阶段以及其表面的表层蛋白对其黏附Caco-2细胞的影响,并通过体内试验进行验证。通过5 mol/L LiCl处理提取菌体表面的相关蛋白,采用透射电镜和SDS-PAGE进行分析鉴定。初步探讨KLDS1.0901的黏附机制,分析其表层蛋白的特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌KLDS1.0901 分离自中国新疆地区发酵酸马奶,保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室;人体结肠腺癌细胞系Caco-2细胞株 中国科学院上海细胞库;MRS培养基 采用参考文献[9]的方法制备;高糖DMEM培养基 美国HyClone;青霉素-链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶-EDTA、牛血清蛋白 美国Gibco公司;MULTICELL胎牛血清 UK;cFDA-SE 碧云天;BALB/c小鼠 6～8周龄,许可证号SCXK(黑)2013-001,黑龙江品臣科技有限公司。

ZHWY-100B型台式振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司;DB-3B型电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;HVE-50型高压灭菌锅 日本HIRAYAMA公司;GL-21M型高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所有限公司;DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;Heal Force型细胞培养箱 力康医疗生物科技控股有限公司;DMLB型光学显微镜 德国徕卡显微镜与系统公司;H-7650透射电子显微镜 日本日立公司;SectrumLab54型紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司;Aira II流式细胞仪 美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌的培养 供试菌株嗜酸乳杆菌KLDS1.0901在试验前需进行复苏与纯化,经MRS液体培养基,37 ℃培养,连续传代3次以恢复菌种活力,后用无菌PBS缓冲液(pH7.2)洗涤菌体,并用PBS调整到所需浓度。

1.2.2 Caco-2细胞的培养 从液氮罐中取出Caco-2细胞,将冻存管迅速置于37 ℃水浴中复苏细胞,4 ℃ 1000 r/min离心5 min,收集细胞后,加入4 mL双抗高糖DMEM培养基(10%的热灭活胎牛血清、1%青霉素-链霉素),置于37 ℃、5% CO2条件下培养,每隔1～2 d更换培养液;待细胞生长状况良好时(70%～80%融合),进行传代。用于黏附测定的Caco-2细胞,单层细胞培养于24孔板中,接种量为105CFU/mL,单层细胞培养10 d左右时,达到极化状态后,即可用于黏附试验,在进行黏附试验前24 h 需更换不含双抗的高糖DMEM培养基。

1.2.3 菌液浓度对黏附作用的影响 参照陈臣等[13]的方法并略做改动。将培养好的极化细胞接种在24孔板中,待其在孔板底部形成单细胞层后,用无菌的PBS溶液洗涤2次,再将500 μL不同浓度(107、108、109、1010CFU/mL)的嗜酸乳杆菌悬液加入到孔板中,37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h后,用PBS溶液洗涤24孔板中每孔的单层细胞层3次以上,以洗脱没有黏附的细菌和代谢分泌物。然后向每个孔中加入250 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育10 min;再加入250 μL血清终止消化;收集每个孔内溶液,并分别进行10倍梯度稀释,采用平板菌落计数法检测培养后菌株的活菌数(V1)。V0为加入到24孔板中总的活菌数。黏附率(%)计算如下:

黏附率(%)=(V1/V0)×100

1.2.4 生长阶段对黏附作用的影响 选择对数初期、对数生长中期、对数末期、稳定末期的KLDS1.0901的菌体进行黏附实验。采用比浊法测定KLDS1.0901的生长曲线[12]。取4、8、12、16、20 h时期的菌体,并调整其浓度为108CFU/mL。取不同生长时期的菌悬液500 μL,加入到铺满单细胞层的24孔板中,37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h。黏附率的计算方法同1.2.3。

1.2.5 嗜酸乳杆菌的表层蛋白对黏附作用的影响

1.2.5.1 嗜酸乳杆菌的荧光标记 用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成1 mmol/L cFDA-SE储备液,进行荧光标记[3]。具体配制方法:称取5.0 mg cFDA-SE溶解于8.969 mL DMSO溶剂中。再过滤膜(0.22 μm)除菌,最后储存在-20 ℃中备用。将菌体重新悬于PBS溶液中,配制活性嗜酸乳杆菌溶液(108CFU/mL)、去除表层蛋白的嗜酸乳杆菌溶液(108CFU/mL)、热致死嗜酸乳杆菌溶液(108CFU/mL)。热致死嗜酸乳杆菌由活性菌体在70 ℃水浴锅中加热30 min制得。再分别向制备的乳杆菌悬液中加入cFDA-SE储备液,至最终浓度为20 μmol/L,37 ℃避光静置15 min,4 ℃ 8000 r/min离心10 min,再用PBS(pH7.2)洗涤三次,除去多余的荧光染料。再分别重悬于无菌PBS溶液中。用流式细胞仪检测分析cFDA-SE标记情况(激发波长为488 nm)。

1.2.5.2 除去嗜酸乳杆菌的表层蛋白 先在24孔细胞培养板中准备好分化的单细胞层,用无菌PBS溶液洗涤两次。再分别向每孔中加入500 μL去除表层蛋白的嗜酸乳杆菌[11]并进行荧光标记。加入相同体积浓度的未除去表层蛋白的嗜酸乳杆菌作为对照,37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h。将不经任何处理的嗜酸乳杆菌的黏附率的平均值定义为100%,将处理组与未处理组相比得到其相对黏附率。

1.2.5.3 去除表层蛋白的嗜酸乳杆菌与表层蛋白的可逆性结合 表层蛋白与细菌表面的基团通过非共价键连接,不具特异性,故表层蛋白可以与表层蛋白去除的嗜酸乳杆菌可逆性结合[3]。因此,将氯化锂处理过的嗜酸乳杆菌(去除表层蛋白)重悬于对应的表层蛋白溶液中,4 ℃共孵育12 h后,4000 r/min离心5 min,收集菌体,荧光标记后进行黏附实验。

1.2.5.4 表层蛋白对乳杆菌黏附抑制实验 用表层蛋白粗品(提取方法见1.2.7.2)配制0、50、100、150、200 μg/mL溶液先与单细胞层孵育1 h后,用无菌PBS溶液(pH7.2)洗涤3次,再向每孔中加入500 μL荧光标记的KLDS1.0901溶液(108CFU/mL),在37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h。计算相对黏附率方法同1.2.5.2。

1.2.6 体内黏附试验 购买6～8周龄的BALB/c小鼠48只,按平均质量无显著差异随机分成4组,每组12只。分组情况如表1。除对照组外各组小鼠均灌胃200 μL cFDA-SE标记的菌悬液一次(见表1)。灌胃后的所有小鼠均提供充足的普通饲料和饮水。分别在灌胃后的第1、2、4、7 d定时间点脱颈处死小鼠,并在无菌环境下取小鼠的横结肠、回肠、空肠、十二指肠各2 cm,并小心剪开肠壁,小心清理掉肠壁内容物,用载玻片轻轻刮下肠黏膜,并用1 mL无菌PBS溶液反复冲洗肠道内壁,再用0.75%的甲醛固定,避光储存,于488 nm的激发光波长下进行流式细胞仪检测。分析肠道不同位置黏附的cFDA-SE标记的乳杆菌情况。不同肠道嗜酸乳杆菌黏附量计算公式如下:

表1 小鼠分组情况Table 1 Grouping of mice

黏附量(CFU/cm)=乳杆菌总数/2

1.2.7 KLDS1.0901表层蛋白的分离与鉴定

1.2.7.1 透射电子显微镜分析KLDS1.0901表面结构 4 ℃ 8000 r/min离心10 min收集过夜培养的菌体,无菌PBS(pH7.2)洗涤2次。将菌体重悬于5 mL PBS溶液中,作为对照组。处理组将菌体悬浮于5 mL 5 mol/L LiCl溶液中。两组置于37 ℃ 200 r/min摇床孵育30 min。采用Gerbino等[14]的方法。4 ℃ 8000 r/min离心10 min收集菌体,将其悬于2%戊二醛溶液中,固定2 h。固定后的菌体用PBS(pH7.2)洗涤3次,用1%磷戊酸染色1 h,再经乙醇梯度脱水。最后用透射电子显微镜观察并拍摄照片。

将粗提液先过0.22 μm的无菌亲水性微孔滤膜,再将滤液装入透析袋中,透析袋放于装去离子水的水槽中,在4 ℃条件下透析,期间6 h更换一次透析液。用10 g/mL的AgNO3检测透析液,直到没有白色沉淀析出。将透析得到的悬浊液4 ℃ 10000 r/min离心10 min,收集沉淀,将沉淀先在-20 ℃预冻2 h,再-50 ℃冷冻干燥12 h。得到的表层蛋白粗品,保藏于-20 ℃冰箱中,备用。

1.2.7.3 表层蛋白的含量及相对分子质量的测定 表层蛋白含量的测定:采用考马斯亮蓝G250法测定粗提物中表层蛋白的含量[16]。牛血清蛋白标准曲线的制作参照刘延琳等[17]的方法。

SDS-PAGE:采用12%分离胶、5%浓缩胶的SDS-PAGE连续电泳鉴定表层蛋白并测定其相对分子质量。将表层蛋白粗提物溶解在1% SDS溶液中,在2×样品处理缓冲液中加入表层蛋白样品液,沸水浴5 min,上样量为10 μL。电泳电压:分离胶120 V,浓缩胶80 V。并用考马斯亮蓝对凝胶进行染色,乙酸脱色到出现清晰的蛋白质条带。拍照并计算蛋白质样品中表层蛋白的相对分子质量。

1.3 数据处理

实验结果均以平均数±标准差来表示,采用Origin 8.0对实验数据进行做图及拟合处理。运用SPSS 20.0软件,进行独立样本T检验和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌的浓度对黏附性的影响

如图1,不同菌液浓度显著影响对KLDS1.0901黏附能力(p<0.05)。菌体浓度低于108CFU/mL时,随着加入菌体浓度的升高,单细胞层黏附率也在增加,但菌体浓度达到108CFU/mL时,KLDS1.0901黏附率趋于稳定,表明黏附基本上达到饱和。所以动物实验选择浓度为108CFU/mL的KLDS1.0901进行灌胃。

图1 KLDS1.0901浓度对黏附Caco-2细胞能力的影响Fig.1 The effect of KLDS1.0901 concentration on the adhesion ability to Caco-2 cells

2.2 乳杆菌的生长阶段对黏附性的影响

根据KLDS1.0901的生长曲线图(图2),分别选择对数初期(4 h)、对数生长中期(8、12 h)、对数末期(16 h)、稳定末期(20 h)的KLDS1.0901的菌体进行黏附实验,结果如图3所示。KLDS1.0901在对数生长末期(16 h)的黏附率最高。且当培养时间小于16 h时,黏附的细菌数随着菌龄的增加而显著增加(p<0.05),稳定末期黏附率趋于下降,但无明显差异。表明对数末期或稳定初期的KLDS1.0901黏附能力最好。

图2 KLDS1.0901的生长曲线Fig.2 The growth curve for KLDS1.0901

图3 KLDS1.0901生长阶段对黏附Caco-2能力的影响Fig.3 The effects of KLDS1.0901 growth stages on the adhesion ability to Caco-2

2.3 表层蛋白对KLDS1.0901黏附性的影响

2.3.1 乳杆菌的荧光标记结果 如图4所示,cFDA-SE荧光染料标记对菌体的标记率均达到99%以上,可用于后续实验。

图4 cFDA-SE标记荧光染料标记乳杆菌的效果Fig.4 Effect of cFDA-SE fluorescent dye labeling lactobacillus 注:A:未标记的KLDS1.0901;B:标记的KLDS1.0901;C:标记的去除SLP的KLDS1.0901;D:标记的热致死KLDS1.0901。

2.3.2 处理方式对黏附性的影响 表面蛋白具有可逆地与细胞壁再次结合的能力[18]。由表2可知,与未处理的KLDS1.0901对Caco-2细胞的相对黏附率相比,经过5 mol/L LiCl去除表层蛋白KLDS1.0901的黏附率下降显著(p<0.05),是未处理乳杆菌黏附率的60%。而菌体去除表面蛋白后再与表面蛋白孵育12 h后进行黏附实验,其黏附率相对于去除表层蛋白菌体增加了10%。部分表层蛋白可能可逆地与细胞壁进行了再次结合。可见,表层蛋白对嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的黏附特性影响较大。

表2 处理方式对KLDS1.0901黏附能力的影响Table 2 Effects of treatment methods on adhesion ability of KLDS1.0901

2.3.3 表层蛋白对KLDS1.0901黏附性验证 图5可知,随着加入表层蛋白浓度的增加,嗜酸乳杆菌的相对黏附率也随之降低,说明表层蛋白抑制了乳杆菌与细胞的黏附。可能由于表层蛋白先占据细胞上的黏附位点,从而降低了乳杆菌的黏附性。

图5 表层蛋白对KLDS1.0901的黏附能力抑制实验Fig.5 The inhibition of KLDS1.0901 SLP to the adhesion ability

2.4 体内黏附能力评价

为进一步验证表层蛋白对嗜乳杆菌KLDS1.0901体内黏附性的影响,用cFDA-SE标记处理方式不同的乳杆菌给小鼠灌胃,分别在灌胃后的第1、2、4、7 d用流式细胞仪检测标记的乳杆菌在小鼠肠道中的黏附分布情况,结果如图6所示。未处理的KLDS1.0901、去除SLP的KLDS1.0901和热致死KLDS1.0901在肠道的不同部位黏附率不同,但未处理的菌体黏附率后期较高。在十二指肠中,去除SLP的KLDS1.0901在第1 d的黏附数量多于未处理及热致死的KLDS1.0901,但是在第2 d显著下降(p<0.05),无黏附能力;而未处理的KLDS1.0901在第2 d黏附数量最高,并在第2、4和7 d显著高于去除SLP和热致死的KLDS1.0901。空肠中,随着时间的增加,去除SLP的乳杆菌黏附于小肠数量显著减少(p<0.05)。末端回肠和结肠是未处理KLDS1.0901黏附定植的主要部位。第7 d,未处理KLDS1.0901在回肠和结肠的黏附量都比较高,而且呈增长趋势。回肠中未处理KLDS1.0901的黏附数量一直明显高于去除SLP和热致死组;在结肠中,未处理KLDS1.0901的黏附数量随着时间的延长一直在增加,且显著高于去除SLP组(p<0.05),而去除SLP组和热致死组的黏附量在第2 d后不断减少。综上所述,KLDS1.0901的表层蛋白显著影响着其黏附特性,这与体外试验结果基本一致。

图6 KLDS1.0901表层蛋白对其黏附小鼠肠道能力的影响Fig.6 Effect of KLDS1.0901 surface layer protein on its intestinal adhesion to mice

2.5 KLDS1.0901表层蛋白的鉴定

2.5.1 KLDS1.0901表层结构的显微观察 如图7所示,在透射电镜下,可以看到未处理的KLDS1.0901细胞壁外围包裹着表层结构,但经LiCl处理后,表层结构即消失。这与孟君[18]观察到的乳杆菌表层蛋白结构类似。

图7 透射电镜观察嗜酸乳杆菌的表层结构(20000×)Fig.7 Observation of the cell surface structures by transmission electron microscopy(20000×)注:A:未处理的KLDS1.0901;B:除去SLP的KLDS1.0901。

2.5.2 表层蛋白的含量及相对分子质量 如图8,牛血清蛋白的线性关系较好。当表层蛋白粗品浓度为300 μg/mL 时,其在A595处吸光值为0.4±0.05,粗品中表层蛋白含量约为15.6%。

图8 牛血清蛋白标准曲线Fig.8 The standard curve bovine serum albumin

如图9所示,两个不同浓度的粗品蛋白经SDS-PAGE分析后,均出现了一条较宽且清晰的电泳条带,说明KLDS1.0901主要含一种表层蛋白,且分子量大约在43 kDa。这与已报道的L.acidophilusATCC 4356表层蛋白相对分子质量(43.6 kDa)相接近[19]。

图9 嗜酸乳杆菌KLDS1.0901表层蛋白粗提物图谱Fig.9 SDS-PAGE of SLP extractions from L. acidophilus KLDS1.0901注:1,2:0.8 mg/mL的表层蛋白粗提物;3,4:0.5 mg/mL的表层蛋白粗提物。

3 结论与讨论

本试验通过体内和体外证明了嗜酸乳杆菌KLDS1.0901表层蛋白能显著影响其黏附特性,并且活性嗜酸乳杆菌KLDS1.0901能较好的黏附于小鼠肠道。KLDS1.0901含有丰富的表层蛋白,含量约为15.6%,相对分子量为43 kDa左右。所以KLDS1.0901具有益生菌的潜力。

乳杆菌可通过抑制病原体的侵袭,改善肠道上皮屏障功能,调节宿主免疫系统等来发挥有益作用。而乳杆菌在胃肠道中的黏附和定植是其在人体内表现益生功效的先决条件[20]。乳杆菌浓度、生长状态和表层蛋白均显著影响菌体黏附量。谢琼[21]发现,植物乳杆菌ZDY2013对Caco-2细胞的黏附存在着浓度依赖性关系,在实验浓度范围内,该菌的黏附数量随着菌悬液浓度的增加显著提高。而本试验中,当KLDS1.0901的浓度增大,黏附Caco-2细胞的数量也随之增加,但当菌体浓度在108CFU/mL以上时,其黏附性没有显著差异,说明细胞表面黏附素受体被占用完。乳杆菌在不同生长阶段的细胞活性,形态大小、代谢产物、表面生长速率存在差异。Savage[22]研究了22株乳杆菌生长阶段与黏附的关系,发现大部分乳杆菌在稳定期的黏附能力要好于指数期。这与本实验结果相似。本实验表明,对数生长末期的嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的黏附性最大,这可能是因为其在对数生长末期,细胞形态趋于完整,且表达较高的黏附素。

乳酸菌的黏附分为非特异性黏附和特异性黏附[23-24]。非特异性黏附是借趋化作用使细菌和易感宿主细胞表面接近及定位,继之细菌粘附素与易感宿主细胞表面处于静电荷及疏水性结合;第二步是特异性的,即在第一步的基础上,黏附素进一步与相应的特异性受体结合。通过本实验结果表明,KLDS1.0901表面的表层蛋白能够特异性与Caco-2细胞表面的受体特异性结合,而具体与那种受体物质作用还需要进一步深入探究。目前有关乳酸菌黏附素受体的研究很少。早前Mukai[25]对罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的研究表明,其能特异性地与肠上皮细胞外侧的糖脂和硫苷脂结合,这两种成分可能是黏附素受体。本实验进一步从体内实验验证了表层蛋白确实能影响KLDS1.0901在小鼠肠道内的黏附定殖情况。

经过荧光标记的活性KLDS1.0901能较好地黏附于小鼠肠道,在肠道各部位的黏附量存在差异。第1 d主要黏附于十二指肠和空肠,随着时间的推移,KLDS1.0901趋向于黏附结肠。而去除表层蛋白和热致死的KLDS1.0901虽然在第1 d能大量黏附于十二指肠,但是只能短暂停留于肠道各部位,随着时间推移,这两组在肠道各部位的黏附量显著减少。

本研究通过透射电镜观察KLDS1.0901的表层结构、和用SDS-PAGE分析表层蛋白粗品,对嗜酸乳杆菌表面的表层蛋白进行了初步鉴定,但具体的功能与结构需进一步分析。而嗜酸乳杆菌的表层蛋白分子量多在41～49 kDa之间[18]。已报道L.acidophilusNCFM和L.acidophilusM92表层蛋白的分子量分别约为46 kDa[26]和45.0 kDa[27],而L.acidophilusATCC 4356 的两种表层蛋白相对分子质量分别为43.6和44.9 kDa[28]。本试验通过考马斯亮蓝G250测定了粗品蛋白中表层蛋白的含量大概在15.6%左右。SDS-PAGE分析表层蛋白粗品,可以看到一条较宽且明显的蛋白条带,分子量大约为43 kDa。所以,可以确定KLDS1.0901含有大量表层蛋白,且分子量约为43 kDa,并且表层蛋白在KLDS1.0901黏附Caco-2细胞和小鼠肠道中发挥重要作用。