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(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000)

苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA),即2-羟基-3-苯基丙酸,结构式如图1,第二个碳原子为手性碳原子,因此有两种对映异构体,即D-PLA和L-PLA[1]。苯乳酸具有很好的亲水性,能够在各种食品体系中均匀扩散;苯乳酸有良好的稳定性和安全性[2-4],可以从多种乳酸菌发酵食品中得到[5-6]。乳酸菌是世界公认安全(General recognized as safe,GRAS)的微生物,千百年来作为益生菌,广泛应用于发酵、保藏和开发新产品。鉴于苯乳酸的天然优势,它被认为是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸,第二代抑菌物质如nisin等细菌素以外的新的潜在天然防腐剂[7]。

图1 苯乳酸的对应异构体结构图Fig.1 Corresponding isomers of phenyllactic acid

抑菌物质的抑菌机理主要有三种:作用于细胞壁和细胞膜系统;作用于细胞内酶系统或者功能蛋白;作用在遗传物质或者遗传微粒结构[8]。作为一种新型生物防腐剂,关于苯乳酸抑菌机理的研究报道很少。1998年,Dieulevenx用扫描电镜观察苯乳酸作用前后L.monocytogenes的超微结构,首次报道其作用机理[9]。2005年,Ström等[10]采用双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2D-PAGE)法,探究苯乳酸对食品中丝状真菌(Aspergillus)蛋白质组学的干扰作用,结果表明苯乳酸可改变细胞内某些蛋白质的表达,Ström猜测苯乳酸作用于真菌细胞中的苯丙氨酸脱氢酶。2009年,孟祥晨等[11]发表了国内首篇初探苯乳酸的抑菌机理的相关报道,使用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)和透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察了苯乳酸作用于指示菌前后的超微观结构的变化,研究发现细胞壁和细胞膜可能都是苯乳酸的作用位点。

细胞膜作为细菌能量传递和运输的屏障,具有重要的生理功能,它既能使单个细胞环境保证胞内的稳定代谢,又能调控物质在细胞内外的进出和交换,因此对细菌适应环境和竞争性生存具有重要意义,也成为了抑菌物质主要的作用靶位之一。近年来,研究学者发现,抑菌物质通过细胞膜的蛋白凝聚、活性丧失,形成离子通道,破坏细胞膜的完整性,引起膜通透性改变,最后导致细菌瓦解死亡,即细胞膜损伤机理[12]。目前,对苯乳酸作用于食源性致病菌的细胞膜损伤机理国内报道较少,本文通过研究苯乳酸对L.monocytogenes10403s的细胞膜的通透性和完整性作用机制,探讨了苯乳酸的细胞膜损伤机理,为苯乳酸的天然防腐抑菌效果提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苯乳酸(D-PLA) Sigma公司,纯度≥99%;L.monocytogenes10403s 由河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏;异硫氰酸酯(Fluoresceine isothiocyanate,FITC) Sigma公司,纯度≥99%;碘化丙啶(Propidium iodide,PI) Sigma公司购置,纯度≥99%;其他所用化学试剂 均为国产分析纯;含0.6%酵母浸粉的胰酪胨大豆肉汤培养基(Trypticase soy broth-yeast extract,TSB-YE):胰酪蛋白胨17 g,大豆蛋白胨3 g,葡萄糖2.5 g,磷酸氢二钾2.5 g,氯化钠5 g,酵母浸粉6 g,蒸馏水1000 mL,121 ℃高压灭菌20 min。

EL204分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;PHS-3C pH计 上海精密仪器有限公司;Evolution 220紫外分光光度计 美国Thermo公司;流式细胞仪Accuri C6 Becton Dickinson公司;LABDANCERS25旋涡混合器 广州仪科实验室技术有限公司;F-7000-FL220荧光分光光度计 日本日立公司;Imager.M2荧光显微镜 蔡司公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苯乳酸对L.monocytogenes10403s最小抑菌浓度的测定

1.2.1.1 对数生长期的L.monocytogenes10403s菌菌液的制备 对数生长期的单增李斯特菌的制备[13]:250 mL量程的三角瓶中加入50 mL的TSB培养基,接种量为1%,在恒温振荡培养箱中,37 ℃,200 r/min转速,培养6 h,L.monocytogenes10403s菌生长达到对数期,采用培养基为空白对照,分光光度计下,用培养基稀释菌液得到OD值为0.1的菌液,此时菌液浓度为1×108CFU/mL,培养基稀释100倍,得到1.0×106CFU/mL的菌悬液。

1.2.1.2 苯乳酸对L.monocytogenes10403s最小抑菌浓度的测定 采用液体培养法[13]对苯乳酸作用于L.monocytogenes10403s的MIC值进行测定。将生长对数期的菌液调到1×106CFU/mL,在96孔板中滴加200 μL菌液,同时添加梯度稀释的苯乳酸培养基溶液(32、16、8、4、2、1、0.5 mg/mL)200 μL,等体积混合均匀,每个梯度做三个平行,放入培养箱,培养温度37 ℃,培养24 h,观察菌液的浑浊程度,浑浊与清晰的界限即为苯乳酸对L.monocytogenes10403s的最小抑菌浓度。

1.2.2 苯乳酸对L.monocytogenes10403s细胞膜通透性影响的测定 取对数期的L.monocytogenes10403s菌液5 mL,调菌液浓度为1.0×106CFU/mL,将苯乳酸(2MIC)与上述菌溶液等体积混合,在37 ℃下相互作用1 h。然后在上述苯乳酸-菌液混合液中继续放入6 μg/mL的FITC试剂100 μL在4 ℃下充分染色20 min后,采用转速为4000 r/min,离心机离心5 min,弃去上清,沉淀的菌体用PBS缓冲液(pH7.4)8000 r/min,2 min,清洗两遍,用流式细胞仪专用进样液50 μL悬浮菌体,流式细胞仪(AccuriC6)FL1通道(FITC在488 nm下发射绿色荧光(FL1))测定细胞膜通透性变化。每份悬液检测5000个细胞。数据采集后用流式细胞仪自带的CellQuestPro软件进行分析[14-15]。

1.2.3 单增李斯特菌L.monocytogenes10403s细胞膜完整性的测定

1.2.3.1 流式细胞术法对细菌细胞膜完整性的影响 取对数期的L.monocytogenes10403s菌液5 mL,且菌液浓度为1.0×106CFU/mL,与苯乳酸(2MIC)等体积混合,作用分别为0、15、30、45、60 min后的L.monocytogenes10403s与10 μg/mL的PI在4 ℃下充分染色20 min,采用转速为4000 r/min,离心机离心5 min,弃去上清,沉淀的菌体用PBS缓冲液(pH7.4)8000 r/min,2 min,清洗两遍,采用流式细胞仪(AccuriC6)FL2通道(PI标记细胞在546 nm发射红色荧光(FL2))测定苯乳酸对L.monocytogenes10403s细胞膜完整性影响。

1.2.3.2 荧光显微镜法对细菌细胞膜完整性的影响 参考Hong等[16]的试验方法,利用PI的荧光特性研究苯乳酸对L.monocytogenes10403s细胞膜完整性的作用。取对数生长期的菌液,离心(8000 r/min,5 min),放入800 μL磷酸缓冲液(0.02 mmol/L,pH7.4)悬浮菌液,离心(8000 r/min,2 min),重复两次,清洗菌液,用磷酸缓冲液悬浮得到紫外分光光度值为0.4的菌体溶液,取15个1 mL量程的离心管,分别装200 μL的菌液,分成A、B试验组:A组中每管加入200 μL磷酸缓冲液(阴性对照);B组中每管加入200 μL 磷酸缓冲液溶解的PLA,保持终浓度为MIC,作用温度为37 ℃,作用时间为1 h后,分别在A、B组中加入PI溶液(终浓度10 μg/mL),在4 ℃低温沾染20 min,离心(4000 r/min、10 min),弃去上清,沉淀的菌体用PBS缓冲液(pH7.4)悬浮,继续采用8000 r/min,2 min离心,反复两次清洗杂质,最后将菌体悬浮于200 μL磷酸缓冲液中。

制片:取10 μL上述B组试验组菌液滴在载玻片上,室温半干后盖上盖玻片,荧光显微镜下观察。分别得到白光、相位对比图(phase-contrast)、546 nm激发下的图像。

1.2.4 苯乳酸对细菌作用后的微观结构观察 参考周围等[18]的实验方法,取对数生长期的菌液,收集菌体用磷酸缓冲液(0.02 mmol/L,pH7.4)清洗后重悬为1.0×106CFU/mL的菌悬液。苯乳酸(2MIC)与菌体等体积混合,分成3组,分别作用1、3、6 h后收集菌体:2000 r/min,低温离心5 min;用磷酸缓冲液(2 mmol/L,pH7.4)洗三次菌体后,用2.5%的戊二醛固定12 h;将菌体用乙醇梯度(30%、50%、70%、85%、90%、100%)洗二次;用乙酸异戊酯置换乙醇2次;梯度冷冻(4、-20、-80 ℃)后冷冻干燥4 h后,扫描电子显微镜观察苯乳酸作用后的微观结构变化,对照组用磷酸缓冲液代替。

1.3 数据处理

每份样品重复测定3次,取其平均值。以ZEN显微图像分析系统对实验图像进行分析;CellQuestPro对流式细胞图像进行分析;以Origin 8.0作图软件对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 苯乳酸对L. monocytogenes 10403s最小抑菌浓度(MIC)的测定结果

试验选取PLA培养基溶液7个浓度梯度为16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL,与单增李斯特菌液在37 ℃下作用24 h后,发现在2～4 mg/mL之间有明显的溶液浑浊与清晰的界限,从而得到苯乳酸的最小抑菌(MIC)浓度为2 mg/mL。后续试验全部采用终浓度为最小抑菌浓度的PLA溶液,来完成其对单增李斯特菌的细胞膜完整性和通透性影响的研究。

2.2 苯乳酸对L. monocytogenes 10403s细胞膜通透性的影响

FITC是一个小分子(389.4 Da)荧光标记物,只有当细胞膜通透性改变时,才能发出上绿色荧光[20]。采用流式细胞术和荧光显微镜分析,用FITC标记,在488 nm波长激发下测定苯乳酸对L.monocytogenes10403s的细胞通透性影响,通过流式细胞术分析苯乳酸对L.monocytogenes10403s的细胞膜通透率为90.60%±0.1%,对照组通透率为0.05%±0.03%。

如图2所示,从荧光显微镜100倍油镜观察大部分细胞显示绿色荧光,即被FITC沾染,又由于FITC只有在细胞膜通透性改变了才能发出绿色荧光,图2A是白光下的空白对照图;图2B和叠加图2D与对照组图2C完全无绿色荧光,相比得到PLA改变了L.monocytogenes10403s的膜通透性。

图2 苯乳酸与L. monocytogenes 10403s作用后的FITC通道荧光显微镜图Fig.2 Fluorescence microscopic images of Listeria monocytogenes 10403s cells treated with PLA(MIC)and stained with FITC注:A为白光下的阴性对照;B为实验组FITC通道的荧光图;C为空白组FITC通道的荧光图;D为A和B的合并图。

2.3 苯乳酸对L. monocytogenes 10403s细胞膜完整性的影响

2.3.1 以PI作为探针用流式细胞分析苯乳酸对膜完整性的影响 苯乳酸与L.monocytogenes10403s的结果见表1和图3,从表1中发现随着苯乳酸作用时间的增加,膜完整性破坏的程度也在逐渐增加,如苯乳酸作用时间为15 min时,PI沾染率为17.9%±0.41%,苯乳酸作用时间30 min时,达到27.1%±0.35%,45 min达到58.2%±0.54%,60 min时,达到最高值91.9%±0.1%。图3流式分析图中,横坐标为第二通道的荧光强度,纵坐标为相对细胞数,V3-L和V3-R分别表示完整细胞和沾染细胞所占总细胞的百分数。图3A为未用苯乳酸作用的流式分析图,表明百分之百为阴性,未被PI沾染(V3-L 为100%,V3-R为0%),菌体所在的物理分布(前散射图3A下方图);图3B中,作用30 min,PI沾染率发生变化,阳性菌占到27.1%(V3-L),具有PI荧光强度的菌经过流式筛分向右偏移(图3B下方图);图3C为苯乳酸作用1 h后的流式分析图,表明细胞膜完整性破坏达到最高,已有91.9%(V3-L)的细胞有PI沾染。试验结果表明,苯乳酸破坏了L.monocytogenes10403s细胞膜的完整性。

表1 PLA与L. monocytogenes 10403s相互作用后的PI的沾染比率(%)Table 1 Dyeing rate of L. monocytogenes 10403s with PI after treated by PLA(%)

图3 苯乳酸与L. monocytogenes 10403s作用后的流式分析图Fig.3 FACS of Listeria monocytogenes 10403 after added PLA注:A为空白对照;B为苯乳酸与L. monocytogenes 10403s作用30 min;C为苯乳酸与L. monocytogenes 10403s作用1 h。

2.3.2 荧光显微镜法分析苯乳酸对细菌细胞膜完整性的影响 荧光显微镜是以紫外线为光源,在激发波长下使得被检测物质产生可测的发射波长(即荧光),即便没有白光,也能被观察到用以照射被检物体,然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜能够观察细菌细胞内物质的吸收、运输、分布及定位等[22-24]。研究发现,有些物质,如细胞中的叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

本试验的优点在于采用流式细胞从荧光强度的检测表明膜完整性破坏的同时,采用荧光显微镜镜100倍油镜在546 nm激发下观察PI发出的红色荧光,获得PI进入破损细胞后的效果。空白对照组在PI通道荧光显微图中无细胞被PI染色,即对照组A组图像为黑色,而PLA作用1 h后的实验组B组如图4所示,经过苯乳酸作用1 h的L.monocytogenes10403s被PI沾染后观察菌体荧光变化,图4A为荧光显微镜白光图,图4B为PI通道荧光显微图,图4C为图4A与图4B的导出合成图,即体现PI标记比率,发现有大于80%的细菌比例发出红色荧光,得到MIC浓度的苯乳酸对细胞膜完整性产生破坏作用。

图4 苯乳酸(MIC)与L. monocytogenes 10403s作用1 h后的荧光显微镜图 Fig.4 Fluorescence microscopic images of Listeriamonocytogenes 10403s after treated by PLA(MIC)for 1 h注:A为荧光显微镜白光图;B为荧光显微镜PI通道的电镜图片;C为A与B的叠加表明PI沾染的比例。

结合细胞膜的通透性分析,苯乳酸的分子结构具有两亲性,推测与细胞膜的磷酸双分子层具有一定的亲和力,加上苯乳酸是小分子物质,使得膜对苯乳酸的阻碍减小,从而能够吸附于膜表面,进而进入到细胞内部。虽然膜完整性和通透性都发生了改变,但是不能够说明菌体的活性丧失或者分子泄露,只能说明细胞膜也是苯乳酸对单增李斯特菌发挥抑菌作用的靶位之一[21]。

2.4 苯乳酸对L. monocytogenes 10403s微观结构的影响

苯乳酸对菌体的抑菌效果微观研究采用扫描电子显微镜,最小抑菌浓度的苯乳酸与L.monocytogenes10403s相互作用1、3、6 h后结果如图5所示,图5A为空白对照,菌体形态完好,表面光滑;图5B为苯乳酸与菌体相互作用3 h的微观结构,发现大部分菌体形态完好,一部分菌体表面皱缩,细胞形态发生改变;图5C则是作用3 h后菌体的形态变化发现:表面有明显的孔洞,并且菌体皱缩,疑似有内容物外泄;D则是作用6 h的菌体互相聚集成团,有些细胞已经失去完整形态,并且由于内容物多糖或者蛋白的粘性而发生大量聚集。从苯乳酸对L.monocytogenes10403s作用后的微观结构可以直观的观察到菌体的细胞膜的完整性和通透性都遭到了不同程度的破坏。

图5 苯乳酸(MIC)作用于L. monocytogenes 10403s的扫描电镜微观结构图Fig.5 SEM of Listeria monocytogenes 10403s after treated by PLA(MIC)注:A为空白对照;B为苯乳酸作用1 h;C为苯乳酸作用3 h;D为苯乳酸作用6 h。

从扫描电镜(SEM)微观结构中,可以直观地观察到微米级别的细菌菌体形态,并且能够观察到菌体形态随着苯乳酸作用时间延长的变化。本试验选择的革兰氏阳性(L.monocytogenes10403s)指示菌的形态变化表明,苯乳酸对食源性致病菌有很强的抑制作用,能够使菌体形态在6 h内严重变形,内容物外漏,粘附在一起,达到抑菌效果,并且发挥的作用位点在细胞壁,细胞壁作为细菌特有的形态结构,是抑菌物质理想的抑菌靶位,苯乳酸对细胞壁的作用同时证明了苯乳酸的抑菌优势。

3 讨论

自从苯乳酸的广泛抑菌性能和潜在防腐功能被发现,对其抑菌机理的报道仍然很有限。本试验的扫描电镜则得到了更多的相关信息,与Dieulevenx等[1]的研究结果相同的是,对单增李斯特菌作用6 h后菌体成团,并且有丝状物存在,推测是多糖类物质外泄,使得菌体互相粘连,彼此影响到生理代谢和呼吸,多种因素共同导致并加快了细菌死亡,不同的是在作用3 h的单增李斯特的细胞表面出现了很明显的孔洞,细胞皱缩,表面不再光滑;说明苯乳酸在除了细胞壁的作用位点之外还有其他的作用位点。

2006年,Weeks等[25]研究nisin对单增李斯特菌的抑菌机理时,采用FACS、PI作为与核酸结合的荧光探针,分析nisin对单增菌细胞膜的完整性的影响,发现nisin(8 ng/mL)对稳定期的细胞较对数生长期的细胞具有更好的抑菌效果,且与nisin作用10 min后的细胞完整性破坏率达到59.9%。2012年,Li等[17]研究的抗菌肽P7,是穿膜肽PPTG.20的衍生肽,在其浓度4 μmol/L时既表现出对沙门氏菌的抗菌作用,同样采用PI为荧光探针,流式细胞仪法分析细胞膜完整性发现:P7在与沙门氏菌作用1 h后细胞膜的完整性遭到破坏达到83.47%;细菌细胞膜是细胞结构的主要组成部分之一,具有维持细胞完整与外界隔绝的屏障作用、物质运输作用、受体作用和信息传递作用。苯乳酸对细胞膜的完整性由流式细胞仪测定。PI 是一种常用荧光标记物,能顾标记膜破损细胞,当细胞膜完整性被破坏,PI才能进入细胞与DNA复合,呈现强于未标记细胞20～30倍的荧光信号,以此判断细胞膜的完整性[16]。本文利用PI的荧光特性研究苯乳酸对L.monocytogenes10403s细胞膜完整性的作用。

苯乳酸是两亲性的小分子,本身带有正电荷,在与细胞膜接触时具有吸附在表面的优势,具有更多机会对膜发挥作用,与磷脂双分子层的磷酸骨架结合使得磷酸骨架松散,有缝隙,随着作用时间的增加,膜破坏的程度加深,苯乳酸能够进入细胞,结合本身带有可电离的氢质子,对菌体内部渗透压改变,使得菌体皱缩变形,粘连聚集得到成团的菌体物质,最终实现杀灭细菌的功效。目前,研究发现对膜通透性改变最多的是肽类物质,并且有三种理论来支持:板桶模型、地毯模型、环形孔模型[20]。苯乳酸的抑菌机理模型更贴合桶板模型:具有两亲性的苯乳酸分子既有彼此聚合形成较大的强极性分子基团的同时,附着在细胞膜表面,减弱细胞膜的结合,嵌插入细胞膜中形成离子通道,从微观结构上观察到的孔洞能够证明这一推测;并且荧光显微镜下观察发现,只有苯乳酸作用的菌体在DAPI通道中激发出微弱蓝光荧光。Wang[23]在研究乳酸对大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的抑菌机理时发现,当0.5%(V/V)的乳酸能够在2 h内使得三种菌彻底失去活性,而有乳酸的试验组的细胞膜则有很严重的损伤现象,细胞膜的形态结构还存在,但是细胞膜层状结构的完整性则遭到严重破坏,甚至破损,可以在细胞膜上观察到明显的凹点和裂痕[21]。苯乳酸和乳酸都是乳酸菌代谢产生的有机酸,都具有一定抑菌作用,根据目前的研究成果,推测苯乳酸和乳酸一样都对细菌的细胞膜产生破坏作用,但是破坏方式有所不同。对于苯乳酸对食源性致病菌的抑菌机理有待于深一步研究和完善。

4 结论

苯乳酸对革兰氏阳性菌L.monocytogenes10403s采用荧光探针标记法发现苯乳酸对L.monocytogenes10403s的细胞膜通透性和完整性都有不同程度的破坏:其中FITC(FL1通道)标记对照组的透光率为0.05%,实验组作用1 h后FITC的透光率达到最高值为90.06%,同时,其细胞完整性在与苯乳酸作用1 h后破坏程度最大,PI(FL2通道)沾染率为 91.9%,从荧光显微镜图像中更直观地观察到,大于80%的菌体发出红色荧光。扫描电子显微镜对其微观结构上的菌体断裂、抱团、粘连等现象的观察,为苯乳酸的抑菌机理深入研究提供一定的理论基础。