黄舒颖，张 诚，黄自坤，罗 清，卿 城

(1.南昌大学第一附属医院妇产科，南昌 330006；2.江西卫生职业学院，南昌 330052； 3.南昌大学第一附属医院超声科，南昌 330006；4南昌大学第一附属医院检验科，南昌 330006； 5.南昌大学第一附属医院重症医学科，南昌 330006)

结核感染严重威胁人类健康，是单一病原菌导致患者死亡最高的感染性疾病。世界卫生组织公布的报告显示，全球每年约有700万新发病例，死亡人数高达200万人[1]。当前研究认为，结核病与机体免疫功能密切相关。结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染机体后主要寄生于巨噬细胞内，是典型的胞内致病菌。当机体免疫力强时，巨噬细胞免疫激活，可杀灭胞内寄生的MTB；而人体免疫低下时，MTB可抑制巨噬细胞活化，长期存活于巨噬细胞内[2]。当前的研究对MTB如何逃避免疫反应尚未完全掌握，相关研究对未来结核病防控具有重要意义。

长链非编码RNA (long-noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200 nt的非编码RNA分子，几乎不具有蛋白编码能力。研究证实lncRNA广泛存在于哺乳动物体内，在转录剪切后可直接折叠成高级结构，以 RNA的形式与蛋白、DNA或者RNA结合，对目标靶分子进行转录和转路后水平调控[3]。在免疫调控[4]、肿瘤生长[5]、细胞代谢[6]等多种生物学过程中发挥重要作用。lncRNA人类肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)最先是在肺部肿瘤中被发现，随后证实其在膀胱癌、乳腺癌等肿瘤疾病中发挥重要作用[7]。近年来研究证实MALAT1参与了机体炎症免疫过程，是体内重要的免疫调节因子。ZHAO等[8]研究发现LPS刺激THP-1和RAW264.7巨噬细胞后，细胞内 MALAT1 表达升高，进一步研究发现，MALAT1是通过调控核因子-κB(NF-κB)炎症信号通路调节炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达。PUTHANVEETIL等[9]研究表明MALAT1可调节高糖诱导的内皮细胞炎性反应。目前，有关MALAT1在RAW264.7巨噬细胞抗结核免疫中的作用鲜见报道。本研究拟通过MTB感染RAW264.7巨噬细胞，RT-qPCR检测MALAT1、TNF-α mRNA表达，探讨MALAT1在RAW264.7巨噬细胞抗结核免疫中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 MTB标准菌株H37Rv(ATCC 27294)在本实验室保存；RAW264.7巨噬细胞(中科院上海细胞研究所)；DMSO、DMEM(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Trizol试剂、LipofectmineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司)；逆转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物TaKaRa公司)；siRNA干扰试剂(广州锐博公司)。荧光定量PCR采用Applied Biosystems 7600系统(美国ABI公司)。其他所用试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1巨噬细胞感染MTB模型的建立 将处于对数期生长的RAW264.7巨噬细胞加入24孔板培养(37 ℃、5%CO2)至细胞贴壁良好，H37Rv按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)=5感染巨噬细胞，4 h后PBS清洗细胞并继续培养，12 h后Trizol法提取细胞总RNA。

1.2.2RT-qPCR 在感染后的不同时间点(0、48 h)Trizol法分别提取细胞总RNA，具体实验步骤按试剂说明书进行。RT-qPCR检测细胞MALAT1、TNF-α mRNA表达情况，采用TaKaRa公司逆转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒进行实验，具体的操作步骤、实验条件设置按照试剂盒操作说明书进行。TNF-α[10]：上游引物5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT-3′，下游引物5′-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3′；MALAT1[8]:上游引物5′-CAT GGC GGA ATT GCT GGT A-3′，下游引物5′-CTG CCA ACA GCA TAG CAG TA -3′；内参基因GAPDH[8]:上游引物5′-TGG TGA AGC AGG CAT CTG AC-3′，下游引物5′- TGC TGT TGA AGT CGC AGG AG-3′。

1.2.3siRNA细胞转染 制备MALAT1 siRNA及control siRNA(siNC)，具体由上海Gene Pharma公司完成。siRNA引物序列[8]：上游引物5′- GCG GAA GCU GAU CUC CAA UTT -3′，下游引物：5′- AUU GGA GAU CAG CUU CCG CTT -3′。巨噬细胞分为空白对照组、siMALAT1转染组及siNC转染组。培养的巨噬细胞贴壁良好后，将siMALAT1或siNC转染，根据LipofectamineTM2000转染操作说明书进行操作，转染4～6 h后更换完全培养基，24 h后收集细胞，Trizol提取细胞RNA，RT-qPCR检测siRNA敲减效果。

1.2.4siMALAT1后TNF-α mRNA的表达 siMALAT1后的巨噬细胞与H37Rv按MOI=5的比例对细胞进行感染，48 h后RT-qPCR检测细胞TNF-α mRNA表达。

1.2.5siMALAT1后MTB杀菌功能 siMALAT1后的巨噬细胞与H37Rv按MOI=5的比例进行感染，4 h后用PBS清洗细胞(H37Rv感染后0 h时间点)。分别于H37Rv感染后0、72 h收集并裂解各组巨噬细胞，将裂解液进行系列梯度稀释后立即接种于含有 OADC的7H10固体培养基上，3～4周后进行MTB菌落计数。

2 结 果

2.1H37Rv感染巨噬细胞后MALAT1及TNF-α mRNA变化 RT-qPCR检测显示，感染后48 h细胞内MALAT1和TNF-α mRNA表达均上调(P<0.05)，见图1。

图1 H37Rv感染巨噬细胞后MALAT1和TNF-α mRNA表达情况

2.2MALAT1沉默后对巨噬细胞TNF-α mRNA表达影响 通过RNAi技术成功沉默巨噬细胞MALAT1表达，见图2A。将该细胞感染H37Rv，沉默MALAT1后的巨噬细胞与siNC转染组比较，TNF-α mRNA表达明显增加(P<0.05)，见图2B。

2.3MALAT1沉默对巨噬细胞抗H37Rv杀菌能力的影响 siMALAT1转染组与siNC转染组细胞荷菌量在0 h时差异无统计学意义(P>0.05)。在H37Rv感染72 h后，siMALAT1转染组巨噬细胞内H37Rv的存活率明显减少(P<0.05)，见图3。

图3 siMALAT1对巨噬细胞清除结核菌能力的影响

3 讨 论

随着微生物学、分子生物学、药物化学及医学其他学科的进步，人类在抗结核病治疗方面取得了突破性的进展，但至今仍未实现彻底治愈该病的能力。近年来随着HIV流行、多耐药结核菌的产生，对当前的结核病治疗提出了新的目标。

结核菌是一种胞内寄生微生物，作为结核菌主要宿主细胞的巨噬细胞在抗结核免疫过程中扮演重要角色。巨噬细胞可以直接吞噬和杀伤结核菌，同时也可提呈抗原以激发机体的体液及细胞免疫反应。结核菌可通过阻止巨噬细胞吞噬体和溶酶体融合，抑制巨噬细胞活化等多重方式对抗巨噬细胞的杀菌作用，从而实现了在胞内长期存活，躲避机体免疫清除的目的[11-12]。因此，巨噬细胞抗结核免疫过程在结核病的防控中具有重要的临床及科研价值。

lncRNA曾经被认为是无用的转录分子，然而近年的研究彻底颠覆了人们以往的认知，即lncRNA是一类具有重要调控功能的细胞分子。在免疫系统领域，lncRNA在巨噬细胞[13]、淋巴细胞[14]、树突状细胞[15]等免疫细胞的功能调控方面发挥着重要的作用。已有部分研究显示，lncRNA与巨噬细胞抗结核免疫反应有关，例如lncRNA CD244可调控结核感染过程中CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α分泌[16]。巨噬细胞沉默lncRNA MEG3可增强其对BCG清除能力[13]。这些研究认为lncRNA在结核菌感染巨噬细胞后的细胞免疫反应中发挥重要作用。

本研究选取了跟炎症免疫密切相关lncRNA分子MALAT1，它最早在非小细胞肺癌研究中被发现，之后的大量研究发现该分子与炎性反应密不可分。XU等[17]在对乳腺癌的研究中发现MALAT1可调控炎症相关信号通路PI3K/Akt；ZHOU等[18]发现在口腔鳞癌中MALAT1可影响胞内炎症通路NF-κB活化。PUTHANVEETIL等[9]研究表明MALAT1可调节高糖诱导的内皮细胞炎症因子TNF-α表达。也有研究证实MALAT1与巨噬细胞NF-κB炎症通路活化有关[8]。由于结核菌感染巨噬细胞后会诱发一系列炎性反应，笔者推测MALAT1可能参与了结核菌感染相关炎性反应过程，且当前尚未有MALAT1在H37Rv感染RAW264.7巨噬细胞后表达及作用的相关研究。

本研究结果表明，H37RV感染会上调MALAT1在巨噬细胞中表达；与此同时，细胞内炎症因子TNF-α mRNA表达也上调。表明结核菌感染巨噬细胞后，细胞迅速活化，促炎因子表达上调，这是免疫细胞启动免疫过程以杀伤结核菌的表现。鉴于MALAT1在炎性反应中的调控作用，本文构建了MALAT1沉默的巨噬细胞，之后再感染结核菌，结果发现，siMALAT1后可促进巨噬细胞TNF-α mRNA表达上调，即MALAT1表现出抑制炎性反应的作用。进一步细菌计数实验发现，siMALAT1后可明显增强RAW264.7巨噬细胞对结核菌的胞内清除能力，充分表明了MALAT1积极参与了巨噬细胞感染结核菌后的免疫反应过程。

综上所述，本研究表明结核菌H37Rv感染RAW264.7巨噬细胞后可上调细胞内MALAT1和炎症因子TNF-α mRNA，沉默MALAT1将增强巨噬细胞对结核菌的清除能力，为结核病免疫治疗提供了新的靶点和思路。