付薛艳，黄羽静，王 玲，杨 扬，2△

(1.桂林医学院药学院，广西桂林 541000； 2.广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室，广西桂林 541004)

肝癌是第五大常见的癌症，病死率排名全球第三。目前，治疗早期肝癌的首选方法是手术切除，术后生存率较高，但是许多肝癌患者在确诊时已是晚期，错过了最佳治疗时机，只能依赖化疗或放疗等治疗方式[1]。化疗和放疗都是有着高副作用的方法，对身体损害很大。因此，开发高效、低毒的抗肝癌药物仍是目前的一个研究焦点。长期以来，中草药具有毒副作用小、价格低廉等优点，用于肿瘤的治疗越来越受到国内外学者的关注和认可[2]。

草果为姜科豆蔻属多年生草本植物草果的干燥果实，分布于中国云南、广西、贵州等地，具有燥湿除寒、祛痰截疟、健脾开胃、利水消肿的功能。课题组前期研究发现草果挥发油具有体内外抑制肝癌细胞增殖的作用[3-4]，且通过体内外实验确证了其能够诱导HepG2 细胞凋亡，但目前对其抗肝癌作用的有效成分及作用方式尚不清楚。因此本课题以HepG2细胞为实验对象初步研究了其主要成分香叶醇和对丙基苯甲醛的抗肝癌活性及作用方式，为揭示草果挥发油抑制肝癌HepG2细胞增殖抗肝癌的物质基础和作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料 香叶醇、对丙基苯甲醛均购自美国Sigma-Aldrich公司；人肝癌细胞系HepG2细胞由桂林医学院药理实验室提供；四甲基偶氮唑蓝(MTT)粉末、双抗、胰酶、PBS均购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMSO购自北京索莱宝生物科技有限公司；6孔板、96孔板、培养皿均购自广州JET-BIOFIL公司；培养瓶购自美国Thermo公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司。

1.2仪器 洁净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；分选型流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)；CO2恒温细胞培养箱(MCO-15PC日本三洋)；恒温水浴锅(金坛恒丰仪器厂)；微量振荡器(江苏泰县医疗器械厂)；离心机(上海安婷科学仪器厂)；电热恒温鼓风干燥(重庆银河试验仪器有限公司)；血细胞计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)；酶联免疫检测仪(南宁市精密仪器仪表有限公司)。

1.3方法

1.3.1细胞培养 将肝癌HepG2细胞培养于含10%胎牛血清1%双抗(即100 μg/mL链霉素和100 μg/mL青霉素)的DMEM高糖培养液中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下的细胞培养箱中传代培养，取对数生长期细胞进行实验[5]。

1.3.2MTT法 单独用药：取对数生长期的HepG2细胞制备成每毫升5×104个的单细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，将细胞培养板放在37 ℃、5% CO2培养箱中预培养。待细胞贴壁生长至50%～60%时，吸除旧培养液[6]，每孔单独加入100 μL含香叶醇(终浓度为90、100、110、120 μg/mL)或对丙基苯甲醛(终浓度为90、110、130、150 μg/mL)的DMEM培养液处理HepG2细胞；用等量的DMSO加入未经药物处理的细胞作为对照组；不含细胞的DMEM培养液作为空白组。培养24 h后每孔加入20 μL的MTT，4 h后弃去原培养液，加入100 μL DMSO，于微量振荡器上振荡约20 min至结晶溶解均匀[7]；用酶标仪测定培养板在波长490 nm处的光密度值(OD值)，计算抑制率。细胞生长抑制率(%)=[1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)] ×100%[8]。联合用药：分别联合不同浓度的香叶醇(终浓度90、100、110、120 μg/mL)和对丙基苯甲醛(终浓度90、110、130、150 μg/mL)处理HepG2细胞；用等量的DMSO加入未经药物处理的细胞作为对照组；不含细胞的DMEM培养液作为空白组。根据实验数据采用金正均法[9]计算两药协同作用的指数Q值，Q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，判断两药相互作用的性质[10]。EA、EB为单独用药所得到的抑制率，EAB为联合用药所得到的抑制率。当Q为0.85～1.15时，两药联合使用表现为简单的相加作用；当Q>1.15时，联合用药才具有协同作用；当Q<0.85时，联合用药表现为拮抗作用。

1.3.3AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测 取对数生长期的HepG2细胞，以2×104个/孔的密度接种于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养细胞贴壁生长至70%～80%，吸除旧培养液，分别加入含不同浓度香叶醇(终浓度为80、120 μg/mL)、对丙基苯甲醛(终浓度为80、120 μg/mL)及香叶醇联合对丙基苯甲醛的培养液处理24 h，将培养液吸到15 mL离心管内(含悬浮凋亡坏死细胞)，用冷PBS洗涤贴壁细胞1次，加入0.5 mL的胰酶消化液(不含EDTA)消化6 min，然后加入之前收集的细胞培养液0.5 mL，轻轻吹打均匀，转移至相应的离心管中，1 000 r/min离心5 min。弃去上清液，收集细胞，用1 mL冷 PBS轻轻重悬细胞并计数(细胞数量不少于5×104个)，然后1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入300 μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞,5 μL的Annexin V-FITC混匀，避光，室温孵育15 min,加入5 μL的PI染色，上机前补加200 μL的1×Binding Buffer，30 min内进行流式细胞检测。

2 结 果

2.1单独用药 90、100、110、120 μg/mL香叶醇单独作用于HepG2细胞增殖的抑制率分别为(2.33±0.22)%、(3.25±0.08)%、(9.23±0.06)%、(12.00±0.26)%，90、110、130、150 μg/mL对丙基苯甲醛单独作用于HepG2细胞增殖的抑制率分别为(6.86±0.23)%、(12.86±0.18)%、(14.43±0.30)%、(26.49±0.50)%，香叶醇和对丙基苯甲醛均对HepG2细胞增殖有一定的抑制作用。

2.2联合用药 联合用药处理HepG2细胞的抑制率较单独用药组明显提高(P<0.05)，均表现出协同作用，见表1、2。

2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率 对肝癌HepG2细胞用不同浓度的香叶醇、对丙基苯甲醛单独处理和联合应用处理后，利用AnnexinV-FITC/PI双标法，经流式细胞仪检测。香叶醇浓度为80～120 μg/mL时，HepG2细胞凋亡率为7.94%～9.69%；对丙基苯甲醛浓度为80～120 μg/mL时，HepG2细胞凋亡率为5.35%～5.60%；当香叶醇联合对丙基苯甲醛时，HepG2细胞凋亡率为19.24%～39.48%。与对照组比较，单独用药组促进了肝癌HepG2细胞的凋亡，联合用药组与单独用药组相比促凋亡能力更明显，见图1。

表1 不同浓度联合用药作用于HepG2细胞的抑制率

表2 不同浓度联合用药作用于HepG2细胞的协同作用

A：对照组；B：80 μg/mL香叶醇组；C:80 μg/mL对丙基苯甲醛组;D:120 μg/mL香叶醇组;E:120 μg/mL对丙基苯甲醛组;F:80 μg/mL香叶醇联合80 μg/mL对丙基苯甲醛组;G:80 μg/mL香叶醇联合120 μg/mL对丙基苯甲醛组;H:120 μg/mL香叶醇联合80 μg/mL对丙基苯甲醛组;I:120 μg/mL香叶醇联合120 μg/mL对丙基苯甲醛组

图1各组细胞凋亡率

3 讨 论

肝癌是一个世界性的健康问题，起病较隐匿，病程较短，病死率高，是当前世界上最常见的恶性肿瘤之一，尤其是在亚洲、非洲和欧洲南部，其发病率位居全球肿瘤疾病的第7位，病死率更是高居第3位[11]。肝癌的致癌过程非常复杂，由病毒、化学致癌物等诸多因素引起的肝细胞生长失控而导致的癌变，经历启动-促进-演变等多个阶段的发病过程，与多种基因的调控和表达密切相关。目前肝癌的致病机制尚未研究清楚，疗效亦不确切。中国是肝癌高发地区，其生存率较低，对生命健康的危害极大[12-14]。长期以来，中医药治疗肝癌不断向前发展，其在改善症状、减轻痛苦、延缓进程、延长生命期限方面发挥着越来越大的作用，临床与实验研究也证实了多种中药的抗癌作用，为肝癌的治疗开辟了新的空间[13]。中医药在减轻化疗、放疗的毒副作用，增强机体抗病能力，提高患者的生存质量方面均有明显的效果，是治疗肝癌的一种非常重要的方法[15-16]。香叶醇和对丙基苯甲醛是草果挥发油中最主要的成分，前期大量研究发现，香叶醇抑制细胞氧化应激，减轻血管内皮炎性反应，从而抗动脉粥样硬化；调节血胆固醇、三酰甘油代谢紊乱和抗多种肿瘤细胞增殖等作用[15]。但目前苯甲醛类物质的药理研究比较少见，暂无对丙基苯甲醛抗肿瘤的报道。

本实验选用草果挥发油中最主要的成分香叶醇及对丙基苯甲醛作为研究对象，通过体外实验研究其抗肝癌作用及其作用方式。结果显示，香叶醇和对丙基苯甲醛单用对HepG2细胞增殖均有一定的抑制作用，但不明显。两种药物联合对HepG2细胞增殖的抑制作用明显优于单独用药，说明二者的作用方式很可能不是单独作用，而是通过协同来达到抑制的效果。同时证明这种协同作用是通过诱导细胞凋亡来实现的，这为草果挥发油的进一步应用提供了有效的实验依据。但本研究仅局限于体外实验，草果挥发油诱导细胞凋亡具体作用的有效成分还需要进一步开展体内实验验证。