罗和生， 万一圆， 田 霞， 黄晓东

1.武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060； 2.武汉大学附属同仁医院消化内科

胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺癌最常见的病理类型，占胰腺癌的80%～90%。胰腺癌是一种对人类危害极为严重的恶性肿瘤性疾病，随着人们生活水平的提高，其发病率及病死率呈现逐年上升的趋势，5年生存率<5%。据统计，在中国人群消化系统肿瘤的发病率中，胰腺癌仅占第5位(胃癌排在首位，其次是食管癌，肝癌，结直肠癌)，但病死率位居第2位，仅次于肝癌。其中，男性患病率及死亡率普遍高于女性患者[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长21～25个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA，通过与目的基因mRNA的3′非编码区(3′-untranslated region，3′UTR)的特定区域结合，从而使目的基因降解或抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达。miRNA在肿瘤中作为癌基因或抑癌基因发挥作用。据报道[2-6]，miR-20a-5p在多种肿瘤组织中表达上调，包括肝癌、结肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤等。同时研究还发现，肺癌患者血浆高表达miR-20a-5p提示较低的无病生存率(disease-free survival，DFS)及较短的生存时间(overall survival，OS)[2]。同时有文献报道，在胰腺癌患者组织、血浆中均发现miR-20a-5p的表达升高[7-8]。以上研究均表明，miR-20a-5p可能作为癌基因参与肿瘤的发生、发展。然而，关于其如何介导胰腺癌的发生、发展尚无研究报道。因此，本研究通过检测胰腺癌患者组织及胰腺癌细胞系中miR-20a-5p的表达，探索其参与胰腺癌发生、发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1临床标本收集本研究收集16对胰腺癌组织及对应癌旁组织标本，癌旁组织距离癌灶边界≥3 cm。样本来源于2016年12月至2018年3月武汉市中心医院肝胆胰腺外科行胰十二指肠切除术的手术患者，男10例，女6例，年龄48～65岁，平均年龄55岁。所有标本离体后立即存放于液氮中保存。经术后病理检查，均确诊为PDAC。本研究经院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2胰腺癌细胞株人胰腺癌细胞株PANC-1、MIA PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、SW1990及人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6-C7(H6C7)均购自美国典藏细胞库(ATCC)。其中，PANC-1、MIA PaCa-2培养于DMEM高糖培养基，AsPC-1、BxPC-3、H6C7培养于RIPA 1640培养基，置于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中恒温培养，SW1990培养于L-15培养基，置于37 ℃不含CO2培养箱中恒温培养。所有培养基中均加入质量浓度为100 g/L胎牛血清及质量浓度为10 g/L的青-链霉素制成完全培养基。

1.3主要试剂及仪器DMEM高糖培养基、RIPA 1640培养基、L-15培养基、胎牛血清、胰酶、转染用OPTI-MEM 培养基均购自美国Gibco公司；miR-20a-5p及U6引物、EdU细胞增殖成像试剂盒购自广州锐博公司；RNA提取试剂TRIzol、转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司；荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪公司；miR-20a-5p mimic、inhibitor及相应对照mimic NC、inhibitor NC购自上海吉玛公司引物(序列见表1)；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒购自美国BD公司；荧光定量PCR扩增仪(StepOne plus)购自美国ABI公司；荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.4qRT-PCR检测miR-20a-5p的表达组织及细胞总RNA的提取参照TRIzol试剂说明书进行。采用超微量紫外可见分光光度计检测RNA纯度及浓度，保证OD260/280在1.8左右，OD260/230为1.8～2.0，否则视为质量不合格的RNA。将质量合格的总RNA取1 μg与逆转录试剂及特异的miR-20a-5p逆转录引物(U6作为内参)混合，在15 μl反应体系中，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min进行逆转。然后取4μl逆转录产物cDNA与1 μl miRNA定量引物混合，在20 μl反应体系中，95 ℃变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。U6作为内参，miR-20a-5p的相对表达量在组织中用2-ΔCt计算，细胞系中用2-ΔΔCt(以H6C7表达量作为对照)计算。

表1 miR-20a-5p相关引物序列Tab 1 Related primer sequence of miR-20a-5p

1.5胰腺癌细胞转染效果的检测取对数生长期的细胞AsPC-1、BxPC-3进行铺板，待细胞密度达80%融合后，按照Lipofectamine 2000说明书将miR-20a-5p mimic、inhibitor及相应对照mimic NC、inhibitor NC分别转入孔板内，24 h后提取细胞总RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测转染后胰腺癌细胞中miR-20a-5p mRNA表达水平。

1.6CCK-8检测AsPC-1、BxPC-3细胞活力细胞转染24 h后，将孔板内细胞用胰酶消化下来，在倒置显微镜下用细胞计数板进行计数，按6 000个细胞/孔在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)，每组设5个副孔，24 h后向每孔加入CCK-8溶液10 μl(注意不要在孔内生成气泡)，将培养板置于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱内孵育1 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度进行检测，记为第1天，连续在同一时间监测4 d。

1.7EdU检测AsPC-1、BxPC-3细胞增殖能力细胞转染24 h后，将孔板内细胞用胰酶消化下来，用细胞计数板进行计数，按8 000个细胞/孔在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)，每组设3个副孔。24 h后弃培养基，向每孔加入100 μl 50 μmmol/L EdU溶液(用细胞完全培养基按1 000∶1稀释EdU溶液)将培养板置于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱内孵育2 h；PBS清洗细胞1～2次后每孔加入50 μl细胞固定液(质量浓度为40 g/L多聚甲醛的PBS)室温孵育30 min，弃固定液；每孔加入50 μl 2 mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5 min后弃去；PBS清洗细胞，每孔加入100 μl渗透剂(质量浓度为5 g/L的TritonX-100的PBS)孵育10 min，PBS清洗1次；每孔加入100 μl的1XApollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30 min，弃染色反应液；加入100 μl渗透剂清洗2～3次，弃渗透剂；最后按100 μl/孔加入1XHoechst反应液(用去离子水按100∶1比例稀释)避光、室温孵育30 min进行DNA染色。染色完成后立即于荧光倒置显微镜下进行观测，每孔随机取5个视野进行拍照。

1.8细胞凋亡检测本实验采用Annexin V-PE/7-AAD双染法。将AsPC-1、BxPC-3两种细胞分别分为NC/mimic及inNC/inhibitor各两组。细胞转染48 h后，将其用胰酶消化收集至EP管中，800 r/min离心5 min，收集细胞，弃培养基。用预冷PBS清洗细胞两次，800 r/min离心5 min收集细胞，弃上清。将细胞重悬于500 μl 1XBinding Buffer中，依次加入1∶1的Annexin V-PE和7-AAD(各5 μl)，混匀，室温、避光、孵育15 min，之后进行流式细胞术检测，1 h内完成上机检测。

2 结果

2.1胰腺癌组织及细胞系中miR-20a-5p的表达胰腺癌组织和癌旁组织中miR-20a-5p的表达量分别为10.025±5.540、4.288±1.619，两者比较差异有显著统计学意义(t=3.974，P<0.01)(见图1A)。5种胰腺癌细胞系中miR-20a-5p的表达量相较于正常胰腺细胞H6C7表达均上调(见图1B)。

图1 胰腺癌组织及细胞系中miR-20a-5p的表达 Fig 1 Expression of miR-20a-5p in pancreatic cancer tissues and cell lines

2.2胰腺癌细胞的转染效果检测胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3根据不同处理被分为NC/mimic及inNC/inhibitor各两组。各组均进行qRT-PCR检测，结果显示，miR-20a-5p mimic组在AsPC-1、BxPC-3中表达水平均高于NC组，而miR-20a-5p inhibitor组表达水平均低于inhibitor NC组(P均<0.01)。表明胰腺癌细胞转染miR-20a-5p mimic及inhibitor后分别上调及下调了miR-20a-5p的表达水平(见图2)。

图2 转染miR-20a-5p模拟物及抑制剂后miR-20a-5p的表达 Fig 2 Expression of miR-20a-5p in pancreatic cancer cell lines after transfecting miR-20a-5p mimic and inhibitor

2.3miR-20a-5p促进PDAC细胞的增殖能力

2.3.1 采用CCK-8法绘制AsPC-1、BxPC-3两种细胞生长曲线结果：在AsPC-1、BxPC-3中转染miR-20a-5p mimic相比于转染对照组(NC组)细胞，细胞增殖速度从第2天开始增强，此后在第3天和第4天，miR-20a-5p对PDAC细胞增殖速度的促进作用逐渐得到增强(见图3A、3C)。反之，转染miR-20a-5p inhibitor相比于转染对照组(inhibitor NC组)细胞，细胞增殖速度从第2天开始受到抑制，此后在第3天和第4天，miR-20a-5p inhibitor对PDAC细胞增殖速度的抑制作用逐渐得到增强(见图3B、3D)。统计学分析发现，在第2天、3天、第4天，过表达miR-20a-5p及抑制miR-20a-5p后与相应对照组相比，增殖能力差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 过表达及抑制miR-20a-5p对胰腺癌细胞增殖活力的影响 Fig 3 Overexpression and knock down of miR-20a-5p in pancreatic cancer cells influenced proliferation activity

2.3.2 EdU细胞成像实验结果：带蓝色荧光的代表所有细胞，带红色荧光的代表EdU渗入正在复制的细胞，两者叠加后通过计算红色荧光细胞占蓝色荧光细胞的比例来计算PDAC细胞增殖能力。实验结果表明，在AsPC-1、BxPC-3中转染miR-20a-5p mimic相比于转染对照组细胞，细胞增殖能力增强(见图4E)，而转染miR-20a-5p inhibitor后细胞增殖能力明显减弱，差异有统计学意义(P<0.01，见图4F)。因此，过表达miR-20a-5p能够促进PDAC细胞增殖能力(见图4A、4C)，而抑制miR-20a-5p能够抑制PDAC细胞增殖(见图4B、4D)。

2.4miR-20a-5p抑制PDAC细胞凋亡转染48 h后收集细胞，利用流式细胞仪进行上机检测，结果发现，在AsPC-1、BxPC-3中转染miR-20a-5p mimic相比于转染对照组细胞，细胞凋亡数量减少(见图5A、5C)，而转染miR-20a-5p inhibitor后细胞凋亡能力明显增强，差异有统计学意义(P<0.05，见图5B、5D)。提示miR-20a-5p可以抑制PDAC细胞凋亡。

3 讨论

miRNA参与生命过程的诸多重要进程，据报道，miRNA能调节人类30%的基因，其生物学功能包括参与胚胎发育、细胞增殖、凋亡和分化等，异常表达miRNA可能导致人类各种疾病的发生，其中包括肿瘤的发生、发展。miRNA介导肿瘤发生、发展机制的研究包括扮演癌基因或抑癌基因的角色，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学行为。已有文献报道，在胰腺癌患者组织、血浆中均发现miR-20a-5p的表达升高[7-8]。本研究通过qRT-PCR实验首次在胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中证实miR-20a-5p的表达均上调，提示其可能作为癌基因参与胰腺癌的发生、发展。因此，进一步探讨miR-20a-5p在胰腺癌中是否发挥生物学作用。

肿瘤细胞增殖及抗凋亡活性较正常细胞明显升高，使得恶性肿瘤能够无限增殖。有研究[9]发现，过表达miR-20a-5p能够降低Bim及p21基因的表达水平，表明miR-20a-5p可能参与有三阴性乳腺癌增殖及凋亡等病理过程的发生。本研究通过在胰腺癌细胞中转染miR-20a-5p模拟物(miR-20a-5p mimics)及抑制剂(miR-20a-5p inhibitor)，探讨过表达及敲低miR-20a-5p后对胰腺癌细胞增殖及凋亡能力的影响。通过CCK-8细胞活力实验发现，转染后第2天，miR-20a-5p mimic组细胞活力较NC组明显提高，之后第3、4天，细胞活力一直维持升高状态。反之，miR-20a-5p inhibitor组细胞活力明显受到抑制，且持续维持抑制状态。同样地，EdU实验发现，过表达 miR-20a-5p后，细胞核DNA复制活性明显提高。而干扰miR-20a-5p后，细胞核DNA复制活性明显受到抑制。细胞凋亡实验证实，过表达miR-20a-5p能够促进PDAC细胞抗凋亡能力，而抑制miR-20a-5p表达能够促进PDAC细胞凋亡。上述实验表明，miR-20a-5p在胰腺癌发展过程中确实起到一定作用。

图4 过表达及抑制miR-20a-5p对胰腺癌细胞增殖能力的影响 Fig 4 Overexpression and knock down of miR-20a-5p in pancreatic cancer cells influenced proliferation

图5 过表达及抑制miR-20a-5p对胰腺癌细胞凋亡能力的影响 Fig 5 Overexpression and knock down of miR-20a-5p in pancreatic cancer cells influenced apoptosis

侵袭及转移能力是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的重要生物学特点，也是恶性肿瘤进展的晚期阶段。胰腺癌高侵袭，早转移的特点使得80%的临床患者丧失根治性手术治疗的机会，同时，由于胰腺癌治疗中易发生化学耐药，使得临床治疗胰腺癌受到极大的限制。BAI等[9]发现，miR-20a-5p能够促进三阴性乳腺癌细胞侵袭、转移能力，而这一机制可能是通过下调RUNX3基因的表达实现。同时，研究还发现，miR-20a-5p能激活AKT及p38基因，表明miR-20a-5p可能通过MAPK/AKT信号通路介导宫颈癌的发生、发展机制[10]。最近有文献表明，miR-20a-5p在肿瘤细胞化学耐药中发挥作用。miR-20a-5p通过激活NF-κB通路相关因子的表达从而促进胃癌细胞化学耐药，通过介导上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促进卵巢癌细胞顺铂耐药[11-12]。基于以上研究报道，我们还将进一步探索miR-20a-5p如何介导下游相关基因参与胰腺癌发生、发展及相关机制的研究，为临床治疗胰腺癌患者提供新思路。

综上所述，本研究发现，miR-20a-5p在胰腺癌组织和细胞系中表达均上调，并且通过促进胰腺癌细胞增殖及抗凋亡能力参与胰腺癌的发生、发展。然而，miR-20a-5p参与胰腺癌进展的具体机制及干扰miR-20a-5p的表达后对下游信号因子或通路是否有影响等问题还有待进一步研究。