梁 佳 ，章俊涛，赵鲜鲜，橘勝康，谷山茂人，宫崎里帆，谢 超

(1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室，浙江舟山 316021；3.长崎大学大学院水产、环境科学综合研究科，日本长崎 8 528521)

众所周知，鱼类的肌肉与哺乳动物完全不同，是由血合肉(红肉)和普通肉(白肉)两种肌肉类型构成。而在食品加工领域，普通肉一直以来都是以一种肌肉类型来作为研究对象。实际上鱼类体侧肌被分类为三部分：由表皮到中心依次为血合肉部，中间肉部以及普通肉部。血合肉被命名为红色肉(red muscle)(TypeⅠ)，中间肉为只有鱼类才存在的粉色肌肉(pink muscle)，普通肉是由白色肌肉的Ⅱa 型(TypeⅡa)和Ⅱb 型(TypeⅡb)组成[1-3]。这些肌肉类型的分类是根据肌肉颜色、酶特性、肌肉结构组织学及其代谢特性来进行分类的[4-6]。JABARSYSH，et al[7]的研究表明大部分鱼类的普通肉部分并不是单纯的由白色肌肉(TypeⅡ)构成的，其中都有粉色肌肉细胞呈马赛克样式的混合存在。再者，以往研究表明不同鱼类中粉色肌肉细胞在普通肉中的存在方式及所占的肌肉细胞数量和分布情况各不相同[4，5，8]。

YADA，et al[8]研究表明粉色肌肉细胞在普通肉中存在的比例直接影响鲜度变化。存在比例越高，其鲜度指标K 值越大。此外，鱼体死后僵直也受粉色肌肉存在比例及存在方式影响[7-8]。然而，目前基本上没有相关研究表明粉色肌肉的存在情况与肌肉硬度(弹性)的关系性，即在流行海鲜生食的今天，粉色肌肉细胞的分散存在是否会影响肌肉的品质(质构)尚不清楚。研究者在过去的研究中对养殖鲤鱼冰藏条件下不同肌肉类型的特性进行研究[9]，本研究将继续利用养殖鲤鱼为研究对象，探索粉色肌肉细胞的存在对肌肉质构(质构)的影响。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

1.1.1 原料

鲜活养殖鲤鱼6 尾(舟山市水产市场购买)，平均体质量为8.68±1.15 kg，平均体长为33.5±2.7 cm，购买后运送到实验室，室温下暂养24 h 后立即处理。将活鲤鱼去头、去内脏，脊髓破坏速杀处理，装入聚氯乙烯袋中冰藏保存。

1.1.2 仪器

奥林巴斯BX50 光学显微镜;质构仪RE-3305s。

1.2 实验步骤

1.2.1 组织学切片

取处理后的鲤鱼，从背部沿体侧肌表皮切下1 cm 左右厚度的2 块肌肉组织样品，肉眼辨别粉色肌肉、粉色肌肉与白色肌肉交界层，并在粉色肌肉及粉色肌肉与白色肌肉连接处进行取样，过碘酸雪夫(PAS)和腺苷三磷酸酶(ATPase)染色切片使用[10]。ATPase 染色参照GOLLNICK，et al[11]和GUTH，et al[12]的改良方法制成冷冻切片、PAS 染色将组织样品制成石蜡切片用显微镜观察进行肌肉细胞类型的识别。

1.2.2 利用光学显微镜染色切片计算粉色肌肉细胞存在于普通肉中的比率

利用数码相机将PAS 染色的肌肉横截面切片在光学显微镜下拍摄后，利用Adobe Photoshop 软件对放大的PAS 染色照片进行统计计算，利用NIH Image[13]图像分析软件分析普通肉中存在的粉色肌肉细胞数量比率和粉色肌肉细胞面积比率。每一样品从邻近粉色肌肉层开始于普通肉层，由鱼骨脊髓中心至表皮依次取a、b、c 3 点统计。最终求得的比率为3 处不同染色切片的平均值。PAS 染色所使用的样品即为破断强度测定部位的样品。

1.2.3 数据分析

数据最终形式为平均值(Mean)±标准偏差(SD)，线性回归的参数(斜率，指函数图形与坐标交点到原点的距和相关系数r)利用X、Y 两变量的最小二乘法计算。相关系数的显著水平利用r 值表求得。

1.2.4 肌肉质构的测定

为测定鲤鱼死后肌肉弹性(破断强度)，冰藏2 d 后样本鱼沿体侧线从背部肉取样。取样时垂直于肌肉细胞排列方向、避开筋膜较多部分切下厚度为10 mm 的样品。每一样品通过肉眼识别，避开粉色肌肉层后由鱼骨脊髓中心至表皮依次取a、b、c 3 点测量。测定时垂直于肌肉横截面直径2 mm 的圆柱形探头插入样品中，插入样品瞬间的最大值为破断强度(N·cm-2)。速度为1 mm·s-1测定5 次，去除最大最小值，取平均值[9]。

2 结果分析

2.1 粉色肌肉细胞光学显微镜识别

2.1.1 ATPase 染色观察

ATPase 染色主要是通过肌球蛋白在酸碱条件下的稳定性的不同来辨别其肌肉类型。图1a 为酸处理过的鲤鱼背部肌肉组织的冷冻切片，图1b 为碱处理过的鲤鱼背部肌肉组织的冷冻切片。从图1 可以看出，在同一部位取样的鱼肉切片分别在酸性及碱性条件下处理后，在酸性条件下，粉色肌肉细胞被染成深色，白色肌肉细胞被染成淡灰色，在碱性条件下，粉色肌肉细胞仍然被染成黑色，而白色肌肉细胞无色。由此说明，粉色肌肉细胞无论在酸性或碱性条件下处理仍然保持活性，而白色肌肉细胞在碱性条件下无活性。由此可以辨别粉色肌肉细胞在白色肌肉中的分散存在。

图1 鲤鱼背部肌肉ATPase 染色图Fig.1 Photograph of the cross section of dorsal ordinary muscle in carp stained by ATPase method

2.1.2 PAS 染色观察

对于鱼类肌肉结构来说，沿体侧线表皮到中心依次为红色肌肉层，靠近红色肌肉附近存在较薄的粉色肌肉层(有些鱼类不存在粉色肌肉)、粉色肌肉分散在白色肌肉中的层、白色肌肉层[1]。本次染色的取样部分为通过肉眼观察后的粉色肌肉层以及粉色肌肉与白色肌肉交界处部分。从图2 可以看出，左侧粉色肌肉中糖原含量多的1/3 部分被染成均匀淡灰色，右侧2/3 部分可以观察到，被染成淡灰色肌肉细胞分散在几乎没有被染色的糖原含量较少的白色肌肉细胞中。由此可见，鲤鱼肌肉中存在较薄的粉色肌肉层，并且其粉色肌肉细胞均匀分散在背部肌肉中心的白色肌肉中。

图2 鲤鱼背部肌肉PAS 染色图Fig.2 Photograph of the cross section of dorsal ordinary muscle in carp stained by PAS method

2.2 粉色肌肉细胞分散在普通肉中的细胞数量比率

养殖鲤鱼背部肌肉中粉色肌肉细胞分散在普通肉中的细胞数量比例统计如表1 所示。粉色肌肉细胞存在的数量比例在同一样品鱼不同位置的比率有所不同，为43.7%～68.4%。距离脊椎最近的a 位置粉色肌肉细胞所占比例为50.0%～68.4%，平均值为56.9%；测定位置b 所占比例为43.7%～64.4%，平均值为53.3%；离表皮最近的c 位置测定的粉色肌肉细胞数量比例为50.8%～66.5%，平均值为58.8%。

2.3 粉色肌肉细胞分散在普通肉中的细胞面积比率

养殖鲤鱼背部肌肉中粉色肌肉细胞分散在普通肉中的细胞面积比例统计如表2 所示。粉色肌肉细胞在普通肉中分散存在的面积比率为12.7%～34.7%，距脊髓最近的a 位置为12.7%～29.0%，平均值为18.1%；b 位置为13.2%～34.7%，平均值为18.6%；距表皮最近的c 位置为18.5%～30.6%，平均值为22.9%；由此可见，由中心至表皮，粉色肌肉细胞存在的面积比率逐渐增高。

表1 鲤鱼粉色肌肉细胞分散存在于背部普通肉中的细胞数量比率Tab.1 Interposition number percentages of pink muscle fibers in dorsal ordinary muscle in carp

表2 鲤鱼粉色肌肉细胞分散存在于背部普通肉中的细胞面积比率Tab.2 Interposition area percentages of pink muscle fibers in dorsal ordinary muscle in carp

2.4 破断强度

鲤鱼冰藏第2 天的破断强度结果如表3 所示。即便是同一样品鱼，因测定部位不同破断强度水平各有不同。距脊髓最近的a 位置破断强度为11.2～19.5 N·cm-2，平均值为15.7 N·cm-2；b 位置为11.0～32.6 N·cm-2，平均值为19.7 N·cm-2；距表皮最近的c 位置为18.1～29.4 N·cm-2，平均值为23.2 N·cm-2；由此可见，由中心至表皮，粉色肌肉的破断强度即质构变化逐渐增高。

表3 鲤鱼粉色肌肉细胞分散存在于背部普通肉中的破断强度Tab.3 Breaking force in dorsal ordinary muscle of carp storage in ice

2.5 鲤鱼普通肉中粉色肌肉细胞的分散存在与破断强度的关系

2.5.1 粉色肌肉细胞存在的数量比例与破断强度的关系

鲤鱼普通肉中a、b、c 各位置粉色肌肉细胞存在的数率与其位置的破断强度关系如图3 所示。虽然粉色肌肉细胞存在的数率与其位置的破断强度两者相关性不显著，但仍可以看出两者存在正向相关(r=+0.101，n=17)。

2.5.2 粉色肌肉细胞存在的面积比例与破断强度的关系

鲤鱼普通肉中a、b、c 各位置粉色肌肉细胞存在的面积比例与其位置的破断强度关系如图4 所示。由结果可看出，粉色肌肉细胞的面积在普通肉中分散存在的比例越大，破断强度值越大，即肌肉质构强度越强，两者存在显著的正向相关性(r=+0.540，n=17，p＜0.05)。

3 结论

图3 鲤鱼粉色肌肉细胞存在的数量比例与破断强度的关系Fig.3 Relationship between number percentage of pink muscle fibers and breaking force in dorsal ordinary muscle of carp

图4 鲤鱼粉色肌肉细胞存在的面积比例与破断强度的关系Fig.4 Relationship between area percentage of pink muscle fibers and breaking force in dorsal ordinary muscle of carp

本研究通过对养殖鲤鱼背部普通肉中粉色肌肉细胞的分散存在情况通过ATPase 及PAS 染色进行辨别，并通过PAS 染色后的石蜡切片在显微镜下的拍摄，统计分析出粉色肌肉细胞在普通肉中的存在情况，结合统计的相同位置肌肉的破断强度值进行分析。可以看出，粉色肌肉细胞在鲤鱼背部肌肉中由中心至表皮分散存在的比例(数量及面积)逐渐增加，即鲤鱼背部肌肉中由中心至表皮肌肉质构呈逐渐增加趋势；鲤鱼粉色肌肉细胞在普通肉中的分散存在(数量及面积)的比例与破断强度均呈正相关，其中粉色肌肉细胞在普通肉中分散存在的面积比例与其破断强度呈显著相关性(r=+0.540，n=17，p＜0.05)，由此，鲤鱼粉色肌肉细胞在其背部普通肉中分散存在的比例会影响肌肉的硬度弹性。因不同鱼类的生活环境、代谢特征及饲养情况均可以影响到其粉色肌肉细胞的分布情况[14]，海产鱼或其他淡水鱼类中是否有相同趋势，有待于进一步研究。