陈 瑜，张 博，李铁军

(浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021)

抑郁症作为常见精神疾病，是现代社会中常见且致残率极高的精神疾病。抑郁症在全球的发病率可达5%～12%，随着社会的发展，抑郁症的发病率仍然不断上升，根据国际卫生组织(WHO)相关报道，抑郁症已经成为影响人体健康的主要疾病，其影响性仅次于心脏疾病[1]。5-HT (serotonin)，以色氨酸为前体合成，数目相对较少，在情绪、情感和睡眠中有重要作用。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs) 可选择性地抑制突触前膜对5-羟色胺的回收，增加5-HT 在突触间隙的积累与突触后神经元的兴奋性，能改善抑郁症状[2]。

人类排泄、未使用或过期而直接丢弃的SSRIs 药物通过卫生间等管道系统进入生活废水，并进入环境水体中，在欧洲和北美，据统计每年药物产品以ty-1以上的排量通过污水处理厂的处理废水释放到地表水中[3]。氟西汀和帕罗西汀口服吸收迅速，半衰期较长，消除慢，其主要代谢产物的半衰期更长[4]。由此导致其可长时间存在于环境中，造成水体污染。虽然抗抑郁类药物在环境中的浓度较低，但由于其较高的靶向生物活性和难以被水中微生物降解的特性，其药物活性成分在水体中的痕量污染仍然会对水生态系统中的水生生物和人类健康造成潜在的威胁[5]。根据MINGUEZ，et al[6]的研究，舍曲林、氯米帕明、阿米替林、氟西汀等常见的八种抗抑郁药的预测环境浓度(PEC)都高于10 ng·L-1，超过了欧盟国家认定的最低环境风险评估标准。近年来国际上对于抗抑郁药这类新兴污染物的研究逐渐增多，但在我国的研究仍处于起步阶段[7]。斑马鱼作为一种模式生物，常用于环境监测，并且和人类基因有着高度的同源性。5-HT1A 受体是5-羟色胺系统神经传递的重要调节因素之一[8]。5-HT1A 受体与抑郁症关系密切，且高通量的5-HT1A 受体激活剂可以改善抑郁与癫痫症状[9]。5-HT 转运体(serotonin transporter，SERT)是选择5-HT 再摄取抑制剂的作用靶点。SERT 广泛存在于大脑边缘系统，有研究表明SERT 的mRNA 的分布情况与5-HT 的阳性免疫反应神经细胞是一致的[10-11]。

本研究采用斑马鱼作为目标生物，探讨水体中氟西汀和帕罗西汀暴露后斑马鱼脑组织中5-HT 能神经传导系统关键功能性分子蛋白5-HT1A 受体和SERT 水平的变化情况，了解SSRI 类抗抑郁药物对斑马鱼脑组织中5-HT 能神经传导系统的影响，为进一步研究SSRI 类抗抑郁药物对斑马鱼中枢神经系统的不良影响提供科学依据，为研究其他药物对水生生物的健康损害效应提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

斑马鱼由武汉国家斑马鱼资源中心提供。将自来水曝气除氯后备用。100 尾成年斑马鱼分别置于含有4 L 纯净水的5 L 烧杯中，每个烧杯中25 尾鱼。室温和水温控制在28℃左右，光照自动控制(光照时间08:00-18:00)，分别于早晚各喂食1 次。适应环境10 d 后进行染毒。

1.2 试剂

氟西汀和帕罗西汀购置于Sigma-Aldrich 公司。

动物RNA 抽提试剂盒(R0026)，cDNA 第一链合成试剂盒(D7168M)，SYBR Green qPCR Mix(D7265)，NA-Red 2000X(D0128)，AGarose(ST004L)，DNA 上样缓冲液6X(D0071)，TBE(ST720)，PBS(500 mL)，DEPC水(100 mL)。细胞蛋白抽提试剂盒(P0033)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)，SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒(P0012A)，Western Breeze 试剂盒(Invitrogen WB7103，WB7105，WB7107)，彩色预染蛋白质分子量标准(P0068)，SDS-PAGE 电泳液10X(P0014C)，PMSF(ST506)，Western 半干法转膜液(P0021C)，SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液5X(P0015)，GAPDH Rabbit Monoclonal Antibody(AF1186)，PVDF 膜(FFP24)，BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)，以上试剂购于上海碧云天生物试剂有限公司。β-actin、5-HT1A 受体、SERT 引物(1.0OD*2)，DNA 分子量标准Ladder H2 (50-1031bp，B500345)，购于上海生工生物工程公司。5-HT Transporter Antibody，购于美国IMMUNOSTAR 生物试剂公司。

1.3 仪器

离心机(Eppendorf5424R)，匀浆器(TIANGEN，ose-y30)，QPCR 仪(Applied Biosystems StepOnePlus)，PCR仪(Applied Biosystems 2720)，酶标仪(Thermo Multiskan FC)，超微量分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop 2000C)，琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一，DYCP-31DN)，凝胶成像系统(170-8170 Bio-rad)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(北京六一，DYY-8C)，半干转转膜仪(BIO-RAD Trans-Blot SD 170-3940)。

1.4 动物分组与药物处理

将100 条斑马鱼分为4 组，分别是氟西汀组，帕罗西汀组，氟西汀和帕罗西汀混合组，空白对照组4组，每组25 尾。其中氟西汀组染毒剂量为100 ng·L-1，帕罗西汀组染毒剂量为100 ng·L-1，氟西汀和帕罗西汀混合组两种药物浓度分别为100 ng·L-1[12-13]。分别于染毒后第7 天和第14 天进行实验。

1.5 实时荧光定量PCR

于染毒第7 天和第14 天分别于各组中取6 条鱼，收集脑组织于离心管中，利用mRNA 提取试剂盒提取脑组织中的mRNA，并于提取后通过酶标仪测定mRNA 浓度。

测定完成后马上进行逆转录，使用cDNA 第一链合成试剂盒对5-HT1A 受体和SERT 基因进行逆转录，引物序列如表1[14-15]，反应体系如表2。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 逆转录体系及反应条件Tab.2 Reverse transcription system and reaction conditions

转录完成后的cDNA 产物存于4℃冰箱中。实验前使用PBS 对cDNA 样品进行50 倍的稀释后进行qPCR 实验(表3)。采用2-△△CT法计算5-HT1A 受体和SERT 基因的相对表达量。

对qPCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用琼脂糖凝胶试剂盒制作3%的凝胶，对2 个时期、4 组共8 个样品各上样5 μL 后设置电压120 V，时间40 min，通过凝胶成像仪进行观察。

1.6 蛋白质免疫印迹实验

于染毒第7 天和第14 天于分别于各组中取6 条鱼，收集脑组织于离心管中，使用蛋白抽提试剂盒进行脑组织蛋白提取。提取后立即使用BCA 法蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，绘制标准曲线。测定完成后100℃变性5 min 后，冻存于-80℃备用。

表3 实时荧光定量PCR 体系及反应条件Tab.3 Real-time PCR system and reaction conditions

使用SDS-PAGE 制胶试剂盒配置8%的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶和分离胶比例为1:3，上样前在蛋白质样品中加入蛋白上样缓冲液，上样量20 μL。浓缩胶100 V 40 min，分离胶120 V 120 min。待溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。取出凝胶并裁好适合大小的PVDF 膜及两块厚滤纸，制成三明治夹层，使用半干转膜仪进行转膜。恒流1.5 mA·cm-2，转膜25 min。取出膜后封闭1 h，一抗(5-HT Transporter Antibody，GAPDH Rabbit Monoclonal Anitibody，浓度1:2 000) 4℃孵育过夜，二抗(Western Breeze 试剂盒，Secondary Antibody Solution)稀释1 倍后室温孵育1 h，最后利用碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色。通过Image J 软件分析灰度，进行数据分析。

1.7 统计分析

对qPCR 和Western Blot 结果利用SPSS 20.0 软件进行双因素方差分析，相对表达量用平均数±标准差来表示，SERT 蛋白相对GAPDH 蛋白含量用平均数±标准差来表示，P＜0.05 认定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qPCR 结果

酶标仪测定样品结果260/280 为1.95～1.99。图1，图2 分别为染毒7 d 及14 d 氟西汀组，帕罗西汀组，氟西汀和帕罗西汀混合组以及空白对照组4 组的5-HT1A，SERT，β-actin3 个基因的qPCR 扩增曲线和熔解曲线。

图1 染毒7 d qPCR 的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)Fig.1 Amplification curve (left) and melting curve (right) of qPCR at 7 days after exposure

图2 染毒14 d qPCR 的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)Fig.2 Amplification curve (left) and melting curve (right)of qPCR at 14 days after exposure

统计分析结果显示，天数主效应(P＜0.05)和药物主效应(P＜0.01)均具有统计学意义(表4)。染毒14 d 时5-HT1A 转录水平相对染毒7 d 时升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。氟西汀组5-HT1A 转录水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，帕罗西汀组5-HT1A 转录水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。混合组5-HT1A 转录水平高于空白对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。氟西汀组5-HT1A 转录水平高于帕罗西汀组和混合组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

染毒14 d 时SERT 转录水平相对染毒7 d 时升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。氟西汀组SERT 转录水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，帕罗西汀组SERT 转录水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。混合组SERT 转录水平高于空白对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。氟西汀组SERT转录水平高于帕罗西汀组和混合组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

表4 5-HT1A 及SERT 相对表达量(x±s,n=3)Tab.4 Relative expression levels of 5-HT1A and SERT (x±s,n=3)

图3 染毒7 d 时琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results after seven days of exposure

图4 染毒14 d 时琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis results after fourteen days of exposure

2.2 Western blot 结果

BCA 法测定蛋白浓度结果，7 d 蛋白浓度标准曲线如图5，R2=0.991 7。氟西汀组、帕罗西汀组、混合组和空白组蛋白浓度分别为3.22 μg·μL-1、3.43 μg·μL-1、3.50 μg·μL-1和3.92 μg·μL-1。14 d 蛋白浓度标准曲线如图6，R2=0.992 0。氟西汀组、帕罗西汀组、混合组和空白组蛋白浓度分别为3.10 μg·μL-1、3.28 μg·μL-1、3.49 μg·μL-1和4.01 μg·μL-1。

图5 染毒7 d 时蛋白标准曲线Fig.5 Protein standard curve at 7 days of exposure

图6 染毒14 d 时蛋白标准曲线Fig.6 Protein standard curve at 14 days of exposure

Western Blot 结果如图7。统计分析分析结果显示，天数主效应(P＜0.05)，药物主效应(P＜0.01)均具有统计学意义(表5)。染毒14 d 时SERT 蛋白表达水平相对染毒7 d 时降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。氟西汀组和帕罗西汀组相对空白对照组斑马鱼脑组织中SERT 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。混合组与空白对照组比较SERT 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。氟西汀组斑马鱼脑组织中SERT 蛋白表达水平相比帕罗西汀组和混合组表达水平降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

图7 Western Blot 结果Fig.7 Western Blot results

表5 SERT 蛋白相对表达量(x±s，n=3)Tab.5 SERT protein relative expression (x±s,n=3)

3 讨论

为了解SSRI 类抗抑郁药物对斑马鱼脑组织中5-HT 能神经传导系统的影响，本研究选取SSRI 类抗抑郁药代表药物氟西汀和帕罗西汀，探讨其对斑马鱼脑组织5-HT 系统关键功能分子蛋白5-HT1A 受体和5-HT 转运体水平的影响。5-HT 是一种分布于中枢和外周的吲哚衍生物。脑组织内5-HT 起着神经递质的作用，只占总量的2%。但是它们对认知、运动、疼痛、食欲、交感神经系统的兴奋起着重要的调节作用[16]。5-HT1A 受体是5-HT 能神经传导系统突触前膜上的重要受体之一，是在5-HT 能神经传导系统中与5-HT 结合调控神经递质的释放并传递神经信号的重要环节之一。5-HT1A 受体的相对表达量减少能对5-HT 能神经传导系统产生一定影响[17]。5-HT 在传递神经信号后必须灭活，否则可能会产生中毒反应及5-HT 受体的脱敏。5-HT 必须通过载体转运至细胞内以灭活，这个过程主要依靠细胞膜上的5-HT 转运体来完成。5-HT 能神经元表达SERT 将5-HT 再摄取，抑制5-HT 转运体可导致内在初级传入神经元对5-HT反应增强，影响5-HT 能神经传导系统的正常工作。

本研究结果显示，水环境中氟西汀暴露可引起斑马鱼脑组织中5-HT1A 受体基因和SERT 基因转录水平升高，且随着时间的延长作用越明显。CUNHA，et al[15]的研究结果显示：大鼠在含有氟西汀或帕罗西汀的环境下5-HT1A 受体基因和SERT 基因的表达量都有不同程度的下降。大鼠和斑马鱼都是脊椎动物，但是大鼠是哺乳动物而斑马鱼是鱼类。物种的差异可能是导致机体对药物出现不同反应的原因。在染毒7 d 时，氟西汀组5-HT1A 受体基因的转录水平出现明显地升高，甚至高于染毒14 d 时5-HT1A 受体的转录水平。在AIRHART，et al[18]的研究发现，斑马鱼暴露于含有氟西汀的水环境中24 h 后，其自发性游泳活动会有一个显著下降时期，并于数天后恢复。根据姚丽艳[19]的研究表明，在人体服用氟西汀后数小时内血药浓度会达到峰值，并在10～14 d 达到稳定的血药浓度。因此，在染毒7 d 后5-HT1A 受体基因转录水平出现较为明显升高的原因可能是由于前期药效不稳定引起。水环境中帕罗西汀暴露同样可以引起斑马鱼脑组织中5-HT1A 受体基因和SERT 基因转录水平升高。这与LIN Wanhui，et al[20]的研究结果一致。但是，同等剂量下作用效果不如氟西汀明显。根据陆蘅等[21]的研究表明，帕罗西汀对人体的近期药效优于氟西汀。李培强[22]的研究表明帕罗西汀和氟西汀对人体的治疗效果无明显差异。由此可以推断，物种不同是导致机体对药物反应性不同的主要原因。

研究发现，水环境中氟西汀暴露引起斑马鱼脑组织中SERT 蛋白的表达水平降低，帕罗西汀同样引起SERT 蛋白表达水平降低，并且随着时间的延长作用越明显，这一点与刘志军等[23]的研究结果一致。出现这种现象的原因可能为转录水平的升高正是由于蛋白水平的降低引起，表现为基因转录水平的代偿性升高，以此来实现蛋白质含量的降低。陈茉弦等[24]及李晓锋[25]的研究表明，氟西汀和帕罗西汀对大鼠SERT 蛋白的表达量有明显的抑制作用。AMADOR，et al[26]的研究也表明，氟西汀暴露可以导致斑马鱼和硬骨鱼SERT蛋白表达水平下降。以上结果表明，氟西汀和帕罗西汀可以引起斑马鱼与大鼠SERT 蛋白表达水平降低。

氟西汀和帕罗西汀混合暴露引起斑马鱼脑组织中5-HT1A 受体基因和SERT 基因转录水平升高，但是差异无统计学意义。氟西汀和帕罗西汀混合暴露引起斑马鱼脑组织SERT 蛋白表达水平降低。氟西汀和帕罗西汀同属SSRI 类抗抑郁药物，都是通过选择性抑制突触前释放的5-HT 的重吸收以增加细胞外可以和突触后受体结合的5-HT 水平[15]。出现上述结果的原因可能为氟西汀和帕罗西汀两种药物同时暴露时出现拮抗作用导致。

综合以上结果显示，SSRI 类抗抑郁药物氟西汀和帕罗西汀通过引起斑马鱼脑组织中5-HT1A 受体和SERT 转录水平和表达水平异常，从而干扰脑组织5-HT 能神经传导系统的正常功能，进而影响斑马鱼脑组织5-HT 能系统的正常生理功能。本研究为进一步研究SSRI 类抗抑郁药物对斑马鱼神经系统的不良影响提供科学依据，为研究其他药物对水生生物的健康损害效应提供参考。