田 璐，游翘楚,，迟长凤，宋红彬,，楼 宝，徐冬冬

(1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022)

黄姑鱼Nibea albiflora 属于鲈形目Perciformes、石首鱼科Sciaenidae、黄姑鱼属Nibea，是我国重要的海水经济鱼类，具有生长快、抗逆性强、繁殖力强等特点，是开展近海网箱和池塘养殖的适宜品种[1-2]。随着黄姑鱼繁育技术日趋成熟，其养殖规模在浙江、福建沿海迅速扩大，养殖产量已达8 000 余t，成为我国东南沿海重要的养殖鱼种。但是，近年来我国沿海地区冬季常遭寒潮侵袭，致使养殖海区水温偏低，养殖的黄姑鱼大量冻死，尤以浙江沿海地区为甚，导致经济损失巨大，严重制约了养殖产业的发展。因此，探索黄姑鱼低温应答的分子遗传学机制，培育耐低温(或耐寒)品种显得十分迫切。

鱼类属变温脊椎动物，水体温度的变化可以影响其发育、生长、繁殖、新陈代谢、行为和地理分布等特征[3-4]。当水温急剧升高或降低而超过其耐受范围时，鱼类的生理功能就会受到严重干扰，甚至导致其死亡[5]。早期对鱼类耐低温的研究多从生理、生化等角度寻找和鉴定与低温适应的简单标识物，如血糖、皮质醇、肾上腺素、不饱和脂肪酸、热激蛋白和抗冻蛋白等[6]，这些物质通过直接与对应酶及其它蛋白作用，提高耐低温能力。李大鹏[7]等研究了史氏鲟Acipenser schrenckii，发现温度驯化使血浆皮质醇和血糖水平显著升高，同时影响神经内分泌激素的释放来调控其生长。贾明亮等[8]发现低温胁迫使奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus 腹腔和内脏的脂肪被大量消耗，肌肉中粗脂肪和粗蛋白含量下降，都与对照组有显著性差异。随着低温胁迫的延长，血清中谷草(丙)转氨酶、总蛋白、白蛋白、胆固醇和血糖等显著高于或低于对照组。王飞生等[9]研究了中华绒螯蟹Eriocheir sinensis 肌肉中不饱和脂肪酸含量在越冬期与越冬前后有显著差异。随着高通量测序的发展，转录组学研究在发现与低温适应相关的生物学过程及调控基因的变化等方面显现了巨大的应用潜力，促进了耐低温机制的研究。例如，通过高通量测序研究发现，温度变化会引起鲤Cyprinus carpio、斑马鱼Danio rerio 和线纹美银汉鱼Austrofundulus limnaeus 等鱼类[10-11]的相关基因的表达变化，这些基因主要集中在转录调控、脂类合成、能量代谢等生物学过程。其中，冷诱导RNA 结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)与神经微丝蛋白(neurofilament medium polypeptide，nefm)在低温胁迫下均出现了显著的表达变化。宋文华等研究发现热休克蛋白基因的上调表达是草鱼抵御温度应激的重要生理响应机制。胡金伟等[12]研究了牙鲆Paralichthys olivaceus 耐寒相关基因HMGB1 的克隆及表达特征，结果表明低温诱导免疫相关因子响应应答，增强机体的免疫。在大西洋鲑Salmo salar 和牙鲆等鱼类中，研究发现CIRP 参与环境胁迫的应答过程[13]。本课题组在前期研究中，通过转录组分析，也发现CIRP 和nefm 参与了黄姑鱼的低温胁迫应答过程，表明这2 个基因可能是参与黄姑鱼应答低温胁迫的重要基因[14]。在此基础上，本研究对CIRP 和nefm 基因进行克隆和分子特征分析，明确这2 个基因在低温胁迫下的表达模式及其可能作用，为进一步的黄姑鱼分子育种提供的参考依据和基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的黄姑鱼是在浙江省海洋水产研究所下属的西轩渔业科技岛人工培育。实验开始前2 周随机抽取规格相当且体表无伤、体色正常的6 月龄黄姑鱼200 尾，平均体重为120.35±2.26 g(平均值±SD)，暂养在7 m3的水泥池中。所用海水均经过暗沉淀后并沙滤处理，盐度为28。为保持水质每日换水2 次，每次换水量均保持为100% 以上，总氨氮浓度低于0.1 mg·L-1。水温为18.0±0.5℃，溶解氧≥7.8±0.5 mg·L-1，每天投喂2 次(09:00，15:00)。

1.2 实验方法

1.2.1 低温胁迫实验

前期预实验发现黄姑鱼在18℃的养殖条件下，其半致死温度为7.5℃。实验设置18.0℃对照组和8.0℃低温胁迫组，每组设置2 个平行，每个平行放置30 尾鱼。实验开始后，从18.0℃(此时刻记为0 h)开始以0.1℃·min-1的速率快速降低至8.0℃(兴成机电水族用品有限公司，RESUN，CW-3000A) 进行冷胁迫，温度误差控制±0.2℃，当降至目标温度(8.0℃)时，维持该温度至48 h，并分别在2 h、4 h、24 h 和48 h进行取样。每个处理组随机取3 尾存活的鱼，解剖取其脑、鳃、肝脏和肾脏等组织，采用生理盐水洗净，保存于RNAstore 保存液中，置于-80℃冰箱备用。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 合成

取-80℃保存的各组织样品，以常规Trizol 法提取各组织总RNA。通过1%琼脂糖电泳检测RNA 完整性，紫外分光光度计(Bio-Rad，USA)测定其浓度。样品A260/280 值均在1.8～2.0 范围内。以1 μg RNA 为模板，用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 试剂盒(TaKaRa，大连)对RNA 进行反转录，获得所需cDNA。

1.2.3 黄姑鱼CIRP 和nefm 基因的克隆

黄姑鱼CIRP 和nefm 基因克隆中RT-PCR 及qRT-PCR 的特异性引物如表1。以黄姑鱼cDNA 为模板，克隆CIRP 和nefm 基因。反应体系为25 μL，1×PCR 缓冲液，0.2 mmol/L dNTP，2 mmol/L Mg2+，1 μmol/L正反向引物，2 U TaqDNA 聚合酶，cDNA 模板约200 ng。PCR 反应条件为：94 °C 预变性5 min，94 °C 变性30 s，Tm(°C)见表1，退火30 s，72 °C 延伸30 s，循环35 次；72 °C 延伸10 min。采用1.0 % 琼脂糖电泳检测PCR 产物，选取预期片段大小的条带，用Omega 琼脂糖胶纯化试剂盒纯化，纯化后的目的片段采用ABI3730 进行测序。

1.2.4 序列分析

通过Lasergene 软件对CIRP 和nefm 基因的核心片段序列进行拼接，从而获得黄姑鱼完整的CIRP 和nefm 基因的cDNA 核心序列。利用在线分析软件Predict Protein (http://www.predictprotein.or Scratch ProteinPredictor (http://www.ics.uci.edu/～baldig/scratch/)对CIRP 和nefm 基因的开放阅读框(ORF)进行预测，推测ORF 所编码的氨基酸序列。用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 对预测氨基酸序列包含的信号肽。用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对CIRP 和nefm 及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。通过Expasy-ProtParam (http://www.expasy.org/ tools/ protparam.html)推测蛋白的理论分子量和等电点，采用MEGA 7 软件中的Neighbor-Joining 算法构建系统发育树，不同物种CIRP 建树所用的基因序列号为：人Homo sapiens(NP_001271.1)、小鼠Mus musculus(NP_031731.1)、褐家鼠Rattus norvegicus (AAH69219.1)、热带爪蟾 Xenopus tropicalis (CAJ83306)、美洲鳄 Crocodylus acutus(NP_001274230.1)、玻璃海鞘Ciona intestinalis(BAA77512.1)、大西洋鲑(NP_001133148)、胡瓜鱼Osmerus mordax(ACO09027.1)、牙鲆(AIA63637)、银鲛Chimaera phantasma(NP_001279973)、银鳕鱼Anoplopoma fimbria (ACQ58801)。不同物种CIRP 建树所用的基因序列号为：家鼠(NP_032717.2)、青鳉Oryzias latipes(XP_004075033.1)、底鳉Fundulus heteroclitus(JAR72410.1)、斑马鱼(NP_001104684.2)、大黄鱼Larimichthys crocea(KKF28570.1)、大西洋鲑(NP_001158883.1)、贝氏隆头鱼Labrus bergylta(XP_020514172.1)、银鲛(AFO95338.1)。蛋白质结构域采用SMART 在线工具(http://smart.emblheidelberg.de/)预测。

1.2.5 RT-PCR 及Real-Time RT-PCR

根据黄姑鱼CIRP、nefm 的cDNA 序列分别设计特异性引物(表1)，进行RT-PCR 扩增，检测这2 个基因在不同组织的表达。以β-actin 基因作为内参基因，18℃处理0 h 的黄姑鱼样品的基因表达量作为参照标准，对低温胁迫实验2 h、4 h、24 h 和48 h 的黄姑鱼脑、鳃、肝和肾组织样品提取RNA，制备cDNA，采用Real-Time RT-PCR 分析表达量的相对变化。荧光定量PCR 实验操作参照SYBR Premix Ex TaqTMⅡKit(Tli RNaseH Plus) 试剂盒使用说明。反应体系为：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10.0 μL，灭菌水7.2 μL，cDNA 模板0.8 μL，正反向引物0.8 μL(浓度为10 μmol·L-1)，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL。PCR 反应在ABI 7500 Real Time PCR 仪进行，反应程序为：55～95℃逐渐升温2 min，95℃30 s；95℃5 s，62℃30 s，40 个循环。上述实验进行3 次重复，反应结束后由ABI 7500 Real Time PCR 仪绘制标准曲线并记录Ct值，采用2-△△Ct法分析基因的相对表达量[15]。

表1 黄姑鱼CIRP 和nefm 基因克隆和扩增所用特异性引物Tab.1 Specific primers used in cloning and RT-PCR of CIRP and nefm for N.albiflora

2 结果

2.1 CIRP 的cDNA 序列及结构分析

通过克隆获得黄姑鱼CIRP 基因cDNA 核心序列3 460 bp，其开放阅读框为543 bp，编码180 个氨基酸(图1)。CIRP 的分子量为18.94 KD，理论等电点为8.92，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)为28 个，带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)为25 个。通过BLAST 序列比对分析发现黄姑鱼CIRP 与银鳕、牙鲆、斑马鱼、虹鳟Oncorhynchus mykiss、胡瓜鱼、大西洋鲑蛋白同源性分别为79.03%、78.28%、77.42%、69.86%、69.44%、68.89% (图2)。采用NJ 法构建氨基酸系统发育树(图3)显示：黄姑鱼CIRP 与银鳕的亲缘关系最近，与牙鲆共同构成了一个分支。采用SignalP 4.1 预测在CIRP ORF 区未检测到明显的信号肽。对CIRP蛋白进行跨膜区域和糖基化位点预测，结果表明CIRP 蛋白为膜外蛋白，没有明显的跨膜区域，也没有明显糖基化位点。利用NetPhos 2.0 Server 预测蛋白激酶C(PKC)位点与Ser，Thr，Thy 磷酸化位点，发现在42 Thr、94Ser 具有显著的PKC 位点，而整个翻译区共有16 个Ser，3 个Thr 和9 个Tyr 磷酸化位点。

图1 黄姑鱼CIRP 基因序列及其预测氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequence of the N.albiflora CIRP

图2 黄姑鱼CIRP 与其他物种的氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequences alignment of CIRP among N.albiflora and other species

图3 采用N-J bootstrap 方法构建CIRP 的系统进化树(bootstrap=1 000 次)Fig.3 Phylogenetic tree of nefm by 1000 times N-J bootstrap

2.2 nefm 的cDNA 序列及结构分析

通过克隆获得黄姑鱼nefm 基因cDNA 核心序列1 116 bp，其开放阅读框为1 107 bp，共编码368 个氨基酸(图4)。nefm 分子量为42.69 KD，理论等电点为5.1，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)为51 个，带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)为66 个。通过BLAST 检索分析发现黄姑鱼nefm 与大黄鱼、银鳕鱼、贝氏隆头鱼、底鳉、青鳉及斑马鱼的蛋白同源性都在80%以上(图5)。采用NJ 法构建系统发育树(图6)，发现黄姑鱼与大黄鱼、贝氏隆头鱼的亲缘关系最近，共同构成了一个分支，与青鳉、底鳉、斑马鱼位于一个大的分支。在ORF 区未检测到明显的信号肽和糖基化位点，nefm 同样是一个膜外蛋白基因，没有明显的跨膜区域。利用NetPhos 2.0 Server 预测蛋白激酶C(PKC)位点与Ser，Thr，Thy 磷酸化位点，发现在29 Thr，34 Ser，42 Ser，51 Thr，52 Thr，53 Ser，68 Ser，69 Thr，318 Ser，365 Thr 具有显著的PKC 位点，而整个翻译区共有30 个Ser，14个Thr 和4 个Tyr 磷酸化位点。

图4 黄姑鱼nefm 基因的cDNA 序列及其预测蛋白序列Fig.4 The nucleotide and deduced amino acid sequence of the N.albiflora nefm

图5 黄姑鱼nefm 与其他物种氨基酸序列比对Fig.5 Amino acid sequences alignment of nefm among N.albiflora and other species

图6 采用N-J bootstrap 方法构建nefm 的系统进化树(bootstrap=1 000 次)Fig.6 Phylogenetic tree of nefm by 1 000 times N-J bootstrap

2.3 黄姑鱼CIRP 和nefm 的时间差异表达

采用RT-PCR 对2 个基因进行组织表达分析，黄姑鱼CIRP 和nefm 基因在心、脑、鳃、脾、肝、胃、肾、性腺、肌和鳍等10 个组织中均有不同程度的表达。对黄姑鱼进行低温胁迫，选取表达量较高的脑、鳃、肝、肾组织进行时间差异表达分析。采用qRT-PCR 对2 h、4 h、24 h 和48 h 的不同组织中的CIRP 和nefm 基因的差异表达量进行检测(图4)。在低温实验中，随着处理时间的延长，2 个相关基因的表达呈不同变化趋势。CIRP 在肝脏的表达变化不显著，在鳃、脑和肾中显著变化。在鳃中在2 h 时达到最大值，在2～4 h 内骤减，在24 h 时再达到1 个峰值，在24～48 h 下降。在脑中，0～4 h 期间表达量逐渐上升在4 h 达到最大值，在4～48 h 期间表达量逐渐下降。在肾中在2 h 达到最大值，2～48 h 表达量逐渐下降(图7)。

nefm 在在脑、肝和肾中变化显著，在鳃中变化不大。在脑和肾中在0～4 h 逐渐升高，在4 h 达到最大值，4～24 h 下降，24～48 h 又逐渐上升。在鳃中0～24 h 表达量逐渐下降，24～48 h 再上升。在肝中，0～4 h 逐渐升高，在4 h 时达到最大值，4～24 h 急剧下降，24～48 h 其表达量均较少(图7)。

图7 低温处理下黄姑鱼的CIRP 和nefm 基因在各组织的差异表达Fig.7 The expression of CIRP and nefm genes in N.albiflora tissues in the duration of cold treatment

3 讨论

3.1 黄姑鱼CIRP 和nefm 基因结构和组织表达分析

冷诱导RNA 结合蛋白最早在哺乳动物中发现，其表达量在冷刺激下急剧增加，同时具有调控冷诱导细胞激活抑制作用，因此被视为是冷诱导的标记基因[16]。CIRP 基因属于富含甘氨酸的RNA 结合蛋白家族，序列中都包含一个氨基端共有序列RNA 结合域(consensus sequence RNA binding domain，CS-RBD)。CS-RBD 是RNA 识别基序(RNA recognition motif，RRM)，是RAN 结合基序之一[17-18]，有2 个高度保守序列(一个为八聚体，另一个为六聚体)，分别是核糖核蛋白1,2 (ribonucleoprotein 1,2；RNP1，RNP2)。本研究中黄姑鱼CIRP 氨基酸序列中同样存在RNP1 和RNP2 两个结合基序。其中RNP1 结合基序是八聚体，前6位氨基酸相同，最后2 位氨基酸是赖氨酸和酪氨酸(黄姑鱼、大西洋鲑，银鳕鱼和牙鲆中)或苏氨酸和苯丙氨酸(斑马鱼，胡瓜鱼和虹鳟中)。RNP2 结合基序是六聚体，第3 位氨基酸是异亮氨酸(黄姑鱼、斑马鱼、牙鲆和银鳕鱼中)或缬氨酸(大西洋鲑、虹鳟、胡瓜鱼中)[13,19-20]。

神经微丝蛋白(nefm)基因编码中等神经丝蛋白，是特异表达在外周神经系统和中枢神经系统神经元及其邻近轴突细胞骨架的主要结构单位[21-22]。在鱼类中，中枢神经系统协调应激反应，而这种蛋白质通常被用作神经元损伤的生物标志物[23]，根据GO 注释，nefm 在分子功能上是电子载体，动力蛋白等，在生物学过程上参与信号转导[24]、质子转运等，所以本研究认为nefm 是一个耐寒相关基因。通过组织差异表达分析发现，nefm 基因在黄姑鱼多个组织均有不同程度的表达，这表明nefm 基因可能参与不同的生理活动。但关于该基因在鱼类上的研究还较少，需要进一步的研究。

3.2 黄姑鱼CIRP 和nefm 基因对低温胁迫响应

CIRP 基因是具有调控冷诱导细胞激活抑制作用的冷诱导的标记基因，随着低温胁迫的时间增长，CIRP 在脑、鳃和肾脏组织中显著变化，尤其在0～2 h 其表达量发生了剧烈上调,在鲤鱼和斑马鱼的耐低温实验中，CIRP 基因在低温下同样显示表达上调，上述研究表明CIRP 基因可能参与了生物体抵抗冷胁迫过程。同时，在人类以及小鼠中研究发现CIRP 基因还与炎症反应有关，外界胁迫下，CIRP 基因在肝脏和心脏中有明显上调[25]，通过TLR4-MD2 复合体(Toll-like receptor4(TLR4)-myeloid differentiation factor 2(MD2) complex)来调节CIRP 基因的表达量从而参与炎症反应，所以CIRP 基因可能通过参与炎症反应来提高生物体抵抗力来达到生物体抗寒的效果。关于炎症反应的推测以及不同物种结果差异性的具体原因，在鱼类中都尚未有相关研究，需要进一步的验证。

在低温胁迫下，黄姑鱼nefm 在脑、鳃、肝脏和肾脏均发生了显著变化。在人类中，nefm 是参与调节醛固酮分泌对多巴胺反应的选择性基因[26]，其中醛固酮是调节细胞外液容量和电解质的激素，可以调节细胞的钠钾平衡，而多巴胺又是人体的神经传递物质，与人体的兴奋感有关。所以在鱼类中nefm 可能是通过调节醛固酮来调节鱼体的钠钾转运与多巴胺反应来参与冷应激。多巴胺用以传递生物体遇见胁迫时的神经兴奋，钠钾转运则伴随着ATP 的水解和合成，而能量是环境胁迫下必不可少的成分。

构建黄姑鱼抗低温功能基因超表达载体、建立遗传转化体系和探究能量代谢信号通路等方面内容，将是耐寒生物选育研究工作的方向。近几年基因芯片技术、代谢组学、蛋白质组学、转录组学和基因组学等的完善，更多直接或间接的耐低温甚至耐寒的功能基因将被挑选出来，从而随着研究的深入，鱼类耐寒的生理生化机制及分子机制更加清晰。目前关于nefm 基因参与了生物体抵抗冷胁迫过程的响应机制的研究在鱼类中较少，所以需要更深入的研究。