孟春英，张小军，黄丽英，顾 捷

(浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021)

砷(As)是一种广泛存在于自然界中的类金属元素[1]，砷及其化合物在农业上常用作杀虫剂，工业生产中用于皮毛的防腐、脱毛，玻璃的脱色剂等。随着工业化生产的不断发展，砷的污染日益加剧，其污染源主要为饮用水、食品中的累积，对人类的身体健康威胁越来越大[2]。

砷的毒性大小与其存在的形态密切相关[3]。毒理学研究表明，无机砷的毒性大于有机砷，As(III)比As(V)的毒性强。As(III)化合物易被细胞吸收和蓄积，阻碍细胞呼吸、分裂和增殖，从而导致细胞死亡等[4]。慢性砷中毒会使神经功能紊乱，致癌、致畸形等[5-6]。常见的分离技术包括高效液相-原子荧光光谱(HPLC-AFS)[7-8]和高效液相-电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS)[9-11]等。HPLC 分离能力高，AFS 仪器设备价格低，其线性范围宽、检出限低、灵敏度高、操作简单，所以HPLC-AFS 联用技术应用更广泛。本研究以HPLC-AFS 联用技术测定水产品中无机砷的形态和含量，对GB 5009.11-2014[12]中前处理方法做了改进，缩短了前处理时间，提取条件更温和，杂质干扰少，获得的峰形尖锐。同时以该方法测定了2016 年浙江省324 批次样品中无机砷含量，客观了解浙江省水产品中无机砷含量情况，以期为监测水产品中无机砷含量提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品来自浙江温州的养殖企业及该区域的自然海域捕捞产品包括贝类、蟹类、虾类和鱼类等。样品制备和保存按照SC/T 3016-2004《水产品抽样方法》[13]进行。

1.2 仪器与设备

主要包括ProStar210 液相色谱泵(美国Varian 公司)；SA-10 原子荧光形态分析仪(配SAP-10 形态分析预处理装置，北京吉天仪器有限公司)；砷空心阴极灯(北京有色金属研究总院HAF-2)；阴离子交换色谱柱(美国Hamilton 公司，PRP-X100，250×4.1 mm，10 μm)；AL204 型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；IKA T18 基本型漩涡振荡器(德国IKA 公司)；Centrifuge 5810 台式高速离心机(德国艾本德公司)；pH计(德国Sartorius PB-10)等。

1.3 材料与试剂

砷酸根(AsO43-)溶液标准物质(GBW08667)，质量摩尔浓度(0.233±0.005) μmol·g-1；亚砷酸根(AsO33-)溶液标准物质(GBW08666)，质量摩尔浓度(1.011±0.016) μmol·g-1；一甲基砷(MMA)溶液标准物质(GBWO8668)，质量摩尔浓度(0.335±0.011) μmol·g-1二甲基砷(DMA)溶液标准物质(GBWO8669)，质量摩尔浓度(0.706±0.024) μmol·g-1均来自中国计量科学研究院。甲醇(色谱纯，Merck)；硝酸(色谱纯，Merck)；盐酸(优级纯)；磷酸氢二铵(色谱纯)；硼氢化钾、氢氧化钾为分析纯。

1.4 无机砷形态分析方法

1.4.1 砷标准储备液的制备

将MMA 溶液标准物质、DMA 标准溶液物质、AsO33-标准溶液物质及AsO43-标准溶液物质分别转移至5 mL 的容量瓶中，纯水定容至5 mL，其浓度分别为9.67、22.05、29.39、7.04 μg·mL-1，密封保存于4℃冰箱中，有效期3 个月。

1.4.2 无机砷混合标准使用液的配置

依次准确移取517、227、170、710 μL 的MMA 标准储备液、DMA 标准储备液、AsO33-标准储备液和AsO43-标准储备液于5 mL 容量瓶中，纯水稀释至5 mL，使各组分的最终质量浓度均为1.0 μg·mL-1，现用现配。

1.4.3 样品提取

称取1.0 g 左右大黄鱼Larimichthys crocea 湿样于50 mL 离心管中，加入0.15 mol·L-1硝酸溶液20 mL，涡旋混匀2 min 后于50℃振荡过夜，取出冷却至室温，2 657 g 离心6 min，取5 mL 上清液于15 mL离心管中，加入5 mL 正己烷振荡1 min，去除脂质成分，再次离心(条件同上)，离心后弃去上层正己烷，吸取下清液，过0.45 μm 有机滤膜，待用。

1.4.4 样品测定

选取色谱柱Hamilton PRP-X100(柱长250 mm，内径4 mm)；流动相15 mmol·L-1的磷酸氢二铵(pH=6.0)，流速1.0 mL·min-1；柱温25℃，手动进样100 μL。

形态分析预处理装置参数设置：泵速65 r·min-1；载流7% HCl；还原剂0.5% KOH+1.5% KBH4。

氢化物发生条件：元素灯电流80/45，负高压285 V，载气(氩气)流速400 mL·min-1；屏蔽气(氩气)流速600 mL·min-1。

1.5 标准曲线及方法检出限

砷形态测定曲线：配置1.0 μg·mL-1含MMA、DMA、AsO33-和AsO43-的4 种砷形态混标使用液，用纯水稀释成0、5、10、20、30、50、100 ng·mL-1系列标准溶液，供HPLC-AFS 分析，保留时间定性，峰面积定量。以峰面积为纵坐标，无机砷浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.6 质量控制

选用外标法，在待测样品中加入适量的混合标准使用液，做3 个平行，计算加标回收率和平行样之间的RSD，验证方法的准确度和精密度。

1.7 无机砷含量计算方法

样品中无机砷的含量是亚砷酸根和砷酸根含量的加和。单种形态含量计算公式见式(1)：

式(1) 中ρ-单种待测物的含量，mg·kg-1；c-提取液中单种待测物的含量，μg·L-1；V-提取液定容体积，mL；m-样品的称取量，g；n-稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 色谱及光谱条件优化

流动相15 mmol·L-1的磷酸氢二铵(pH=6.0)，流速1.0 mL·min-1，色谱柱选用Hamilton PRP-X100；泵速65 r·min-1，载流7% HCL，还原剂0.5%KOH+1.5%KBH4；元素灯电流80/45，负高压285 V，载气(氩气)流速400 mL·min-1；屏蔽气(氩气)流速600 mL·min-1。混合标准溶液的色谱图如图1 所示。

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 前处理优化

图1 混合标准溶液中4 种砷形态色图谱Fig.1 Chromatogram of 4 kinds of arsenic forms in standard solution

本研究对GB 5009.11-2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》中的前处理进行了部分改进，以50℃恒温振荡过夜的处理方法代替国标中样品室温放置过夜然后90℃恒温箱中热浸提2.5 h 的处理方法，前处理条件更温和，避免了90℃高温处理2.5 h，此举可以更好的保护砷的形态，避免各砷形态间的相互转化；每批次样品前处理时间可缩短2.5 h，提高了检测效率。

2.2.2 优化结果

同一阳性样品提取值RSD 在2.01%～4.31%。在同一实验条件下，经GB 中前处理方法处理后，As(V)的加标回收率67%～85%，锋形拖尾；经本研究中前处理后，As(V)的加标回收率85%～99%，且锋形较尖锐。

2.3 基质效应的影响

由于基质效应的影响，在实际样品检测中各形态的保留时间和标准品的保留时间会有0～10%的漂移，且DMA 和AsO33-的保留时间非常接近，为了更准确的辨别样品中的砷形态，方法中应该加入MMA 和DMA；其次考虑到MMA 和DMA 也具有轻微毒性，也应该监测样品中MMA 和DMA 的含量，使检测结果更科学准确。

2.4 方法学评价

2.4.1 方法的线性范围、回归方程与定量限

以砷混合标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，2 种砷形态标准溶液线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限如表1，检出限以3 倍信噪比的方法计算得出，定量限以10 倍信噪比计算。

表1 无机砷测定的线性范围、线性方程、相关系数、检出限Tab.1 Linear range,regression equations,correlation coefficients,limits of detection of inorganic arsenic

2.4.2 回收率和精密度

称取样品于50 mL 离心管中，先加入0.6 mL 的4 种砷形态的混合标准使用液，再加入0.15 mol·L-1的硝酸溶液定容至20 mL，做3 个平行。3 次测定的加标回收率：As(III)的均值为98%，RSD 为2.16%；As(V)的均值为95%，RSD 为2.75%；表明2 种形态的无机砷测定数值均在规定范围内，方法的准确度和精密度可以满足检测的要求。样品加标色谱图如图2 所示。

图2 样品加标色谱图Fig.2 Chromatogram of spiked sample

不同形态的砷的毒性存在很大差异，所以对不同砷形态的研究很有必要。邱宗清等[14]用阴离子交换色谱-ICP-MS 法测定了福建花蛤中的砷形态，1.00 mmol·L-1(NH4)2CO3和10.00 mmol·L-1的(NH4)2HPO4梯度洗脱，砷甜菜碱(ASB)、MMA、DMA、As(III)和As(V)在15 min 内分离开。而吴思霖等[15]选用HPLC-AFS 联用技术测定水产品中的无机砷，采用1 mmol·L-1NH4H2PO4(pH 9.0)、20 mmol·L-1NH4H2PO4(pH 8.0)，色谱柱Hamilton PRP-X100，20 min 内将MMA、DMA、As(III)和As(V)分离开。还有部分学者选用等度洗脱，如周秀清[16]选用15.00 mmol·L-1的NH4H2PO4(pH 10.0)为流动相，将As(III)、As (V)、ASB 和MMA 在9 min 内分开，使用仪器为HPLC-ICP-MS，色谱柱为Hamilton PRP-X100。HPLC-AFS[17]联用技术分离海藻中的无机砷，也用等度洗脱，流动相为15 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 6.0)，色谱柱同上，12 min 内将MMA、DMA、As(III)和As(V)分离开。综上所述，多数研究中无机砷的分离多选用阴离子交换柱，流动相多为磷酸盐，流动相pH 影响各形态的出峰顺序及分离度。但存在的共同问题是As(V)峰形较其他3 种差，推测原因是As(V)通常是最后一个出峰，保留时间较长，对峰形有一定影响。这一点还有待验证。

2.5 检测样品测定

结合2016 年浙江省常见水产品中国无机砷的监测数据，本研究对采自浙江温州养殖企业及近海海域的324 个样品的无机砷含量进行分析[18]，具体数据如表2。

表2 检测样品中无机砷测定结果Tab.2 Determination results of inorganic arsenic in aquatic products

由表2 见，324 个样品中67 个样品有无机砷检出，检出率为20.7%。泥蚶Tegillarca granosa 的检出率为18.1%(最高含量为0.39 mg·kg-1)；缢蛏Sinonovacula constricta 检出率为63.0%(最高含量为1.79 mg·kg-1)，有2 个样品(比例为7.4%)无机砷含量超标；青蛤Cyclina sinensis 的检出率为65.6%(最高含量为0.17 mg·kg-1)；厚壳贻贝Mytilus coruscus 共3 个样品，均有检出(最高含量为0.068 mg·kg-1)；远海梭子蟹Portunus pelagicus 的检出率为26.9%(最高含量为0.49 mg·kg-1)；海捕虾、枪乌贼Loligo chinensis、中华鳖Trionyx sinensis 和鱼均未检出。总体来说，贝类无机砷含量最高。

图3 贝类中无机砷含量Fig.3 The content of inorganic arsenic in shellfish

从图3 可以看出，缢蛏中无机砷含量最高，范围0.03～1.79 mg·kg-1，均值为0.3 mg·kg-1，分别是泥蚶，青蛤，贻贝的3.6、3.8、6.3 倍。其次为泥蚶，范围0.03～0.12 mg·kg-1，均值为0.08 mg·kg-1，贻贝含量最低。关于贝类中砷的研究较多。郝云杉等[19]2010 年在浙江省舟山市主要菜场中采集了菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum、缢蛏、牡蛎和贻贝4 种贝类并研究无机砷的含量，发现贝类无机砷含量范围在0.07～0.19 mg·kg-1，菲律宾蛤仔含量最高，缢蛏次之，牡蛎第3，贻贝最低。李学鹏等[20]研究了2006 年杭州市近江市场几种食用贝类中重金属含量，包括牡蛎、菲律宾蛤仔、文蛤Meretrix meretrix和泥蚶，无机砷含量最高的是菲律宾蛤仔(0.78 mg·kg-1)，全部样品的无机砷含量范围在0.11～0.84 mg·kg-1，均值为0.42 mg·kg-1。程家丽等[21]从2001-2015 年发表的文献中收集了中国海洋食用贝类重金属含量数据，报道的区域从海南沿海至大连沿海，包括长江口-浙江沿海、山东沿海、珠江口、渤海湾、福建沿海几大海域，比较了牡蛎、菲律宾蛤仔、缢蛏及贻贝中总砷的含量，缢蛏中总砷含量最高(2.14±3.97) mg·kg-1，贻贝最小(1.2±0.83) mg·kg-1。通常贝类中无机砷的含量约为总砷含量的10%[22]，因此基于获得的数据，缢蛏中无机砷含量约为(0.214±0.397) mg·kg-1，与本研究评估2016 年浙江省贝类中缢蛏无机砷含量最高的结论一致。孙慧玲[23]2013-2014 年在大连主要水产品市场采集了4 种贝类(长牡蛎Crassostrea gigas、虾夷扇贝Patinopecten yessoensis、缢蛏和中国枪乌贼)，分析其体内重金属的含量，发现缢蛏体内的砷含量最高，且其含量显著高于虾夷扇贝和中国枪乌贼。王玲等[24]研究了三门湾海域水产品中的重金属含量发现贝类中砷含量高于甲壳类和鱼类。贝类产品对无机砷的富集能力要高于鱼虾类。这可能是由于贝类生活在底泥中，而重金属在底泥中的含量由于累积作用往往比相应的水体中的含量要高得多[25-26]。也有可能是因为贝类为滤食性生物，对污染物的释放和代谢比鱼类和甲壳类慢，对重金属的富集程度高[27-28]。重金属在体内代谢慢，易积累，所以沿海地区贝类的监管应当受高度重视。

3 结论

本研究选用15 mmol·L-1(pH 6.0)的磷酸氢二铵在8 min 内将DMA、MMA、As(III)和As(V)分离开，加标回收率在80%～99%之间，RSD 范围为1.82%～2.75%。此方法可以满足检测的要求。实际检测过程中，该方法前处理条件温和，时间短，As(III)和As(V)的峰形尖锐，出峰时间稳定，重复性良好，加标回收率和RSD均在要求的范围内。检测的324 个样品，无机砷检出率为20.7%，其中95.6%的样品只含As(III)，4.4%的样品含As(III)和As(V)。贝类的检出率最高，缢蛏体内的无机砷含量最高，超标率为7.4%。建议沿海地区的水产品无机砷监管应当受高度重视贝类，至于贝类无机砷含量能否反映出环境中砷含量的关系还需进一步研究。