谭乔燕 李灿 谢杨丽 罗凤涛 杜晓兰 陈林

关节软骨由于自身修复能力极差，在长期负荷运转中一旦受到异常应力、机械创伤等损伤，往往逐渐引起软骨退变及关节其他组分病变，诱发骨关节炎（OA）。目前OA治疗主要是非手术治疗［1］，药物治疗主要围绕缓解疼痛、抑制炎症等方面，如口服甾体类抗炎镇痛药，而物理治疗主要对持续性疼痛采取关节腔内注射透明质酸、类固醇激素与富含血小板的血浆等。这些治疗难以从根本上缓解OA进展，到OA晚期，全关节置换术是患者仅有的有效治疗措施，而到此阶段，患者生活质量已长时间受到严重影响，且并发症多。激活内源性干／祖细胞适用于较小面积的损伤修复，创伤或疾病引起的关节表面大面积缺损可以借助软骨组织工程移植重建。关节软骨干／祖细胞作为软骨组织工程种子细胞，存在于Ranvier环、脂肪垫、滑膜、软骨膜、关节软骨表层和颞下颌关节髁突表层。

1 软骨膜凹槽Ranvier环干细胞

1873年，Ranvier在骨骺板周围发现1个环形软骨膜凹槽，并命名为Ranvier环。1977年，Shapiro等［2］发现在Ranvier环有一群形态类似间充质干细胞的增殖细胞。在胚胎发育早期，Ranvier环与骨领几乎同时形成，肥大前软骨细胞与骨领相邻并被Ranvier骨化槽环绕，骨领与肥大前软骨细胞始终处于同一水平，Ranvier环是骨领形成的主要细胞来源［3］。Ranvier环区成纤维细胞与干骺端骨膜的延续称为LaCorix软骨膜环，去除LaCorix软骨膜环可导致肢体生长停止［4］。1999年，Robinson等［5］从新生大鼠的LaCorix软骨膜环中分离出前体细胞，并通过成纤维细胞生长因子受体-3免疫磁珠纯化分选，进一步研究发现这群细胞具有增殖并定向分化为软骨细胞的潜能。Karlsson等［6］为进一步研究Ranvier环处这群细胞的干／祖细胞特性，连续12 d注射溴脱氧尿苷（Brdu）标记3月龄新西兰白兔关节软骨细胞，第1次注射后分别在第4、6、10、14、28和56天取材，结果标记后10 d，免疫组化检测显示在骺板、软骨膜凹槽Ranvier环及关节软骨全层有大量Brdu阳性细胞，标记后56 d，在软骨膜凹槽Ranvier环处发现存在一群更新缓慢的细胞，这些细胞表达干／祖细胞相关标记物如Stro-1、Jagged1、BMPr1a等，进一步确认 Ranvier环存在软骨干／祖细胞。

2 髌骨下脂肪垫干细胞

脂肪组织也是获取干细胞的重要来源之一，自2001年Zuk等报道从脂肪组织分离间充质干细胞以来，脂肪间充质干细胞已被证实可诱导分化成多种细胞表型。髌骨下脂肪垫干细胞（IPFPSC）来源于脂肪，易提取，体外扩增快，逐渐得到学者们的认可。有研究从全膝关节置换患者髌骨下脂肪垫分离一群细胞，流式检测显示其间充质干细胞标志物CD44和CD105呈阳性，体外三系诱导分化结果显示具有成软骨、成骨与脂肪的能力，因此认为这群细胞具有典型的干细胞特征［7］。Liu等［8］研究发现，从OA患者分离的IPFPSC与韧带重建患者分离的IPFPSC具有相当的软骨生成能力；IPFPSC通过增加蛋白聚糖基因的表达来增加硫酸糖胺聚糖的表达；进一步研究IPFPSC是否满足临床软骨组织工程移植尺寸（直径≥2 cm）的需求，将IPFPSC接种于电纺左旋聚乳酸（PLLA）纤维膜，培养6周，出现弹性的软骨样移植物，证实从OA患者分离的IPFPSC有用于软骨组织工程移植重建创伤或疾病引起的关节表面大面积缺损的可能性。此外，在培养基中添加转化生长因子（TGF）-β3和骨形态发生蛋白（BMP）-6也可促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达。然而，相对骨髓来源干细胞，脂肪间充质干细胞成软骨分化能力较低，所产生的胞外基质蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白少［9］。

3 滑膜间充质干细胞

至2001年成功分离出滑膜间充质干细胞（SMSC）以来，大量研究证实SMSC可被诱导分化成多种类型细胞［10］。Yoshimura等［11］分离大鼠骨髓、滑膜、脂肪组织和肌肉来源间充质干细胞，2次传代后，SMSC的单克隆集落数比骨髓源干细胞的单克隆集落数高100倍；微团培养研究软骨形成发现，与其他组织来源的间充质干细胞相比，SMSC能产生更多的软骨基质，因此衍生的软骨颗粒较重，表明SMSC较骨髓、脂肪组织和肌肉来源间充质干细胞有更强的增殖和成软骨能力。

Sekiya等［12］对10例股骨髁处软骨损伤患者进行清创术，并将SMSC悬浮液注入软骨缺损部位，术后52个月进行Lysholm评分，MRI和关节镜检查发现软骨修复明显改善。在此基础上，Akgun等［13］将14例膝关节软骨缺损患者随机分为2组，分别植入SMSC和软骨细胞，术后2年进行膝关节损伤和骨关节炎评分（KOOS）、疼痛视觉模拟评分（VAS）分析，发现植入SMSC修复效果较植入软骨细胞好。此外，Koizumi等［14］分离OA和风湿性关节炎患者SMSC，发现SMSC是组织工程化软骨修复有效的细胞来源。

4 软骨膜干细胞

软骨膜是关节面、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处软骨表面的一层结缔组织［15］。软骨膜分为2层，其内层较疏松，富含细胞、神经及小血管，外层纤维较致密，主要起保护作用。

Duynstee等［16］手术分离新西兰大白兔耳廓软骨膜的内外层，通过创伤愈合模型来研究软骨膜内外层的作用，体外培养0、3、7、14和21 d后，免疫组化检测Ki-67、Ⅱ型胶原、TGF-β1和成纤维细胞生长因子（FGF）-2表达，发现从培养第3天开始创伤切边上长出纤维细胞，但没有新的软骨形成；分离去软骨的外层软骨膜，培养21 d后可观察到整个软骨周围有新的软骨形成；同时分离去软骨的内外层软骨膜，培养21 d后伤口表面未见任何改变。该体外实验结果表明软骨膜在软骨伤口愈合中起双重作用：一方面，紧贴软骨处的软骨内膜可增殖分化为软骨细胞；另一方面，软骨外膜迅速向外产生致密纤维，以维持机械功能。

Kobayashi等［17］采用Ⅱ型胶原酶消化及贴壁培养法分离得到一群形态偏长，类似成纤维细胞的软骨膜干细胞（PSC），流式分析发现PSC高表达间充质干细胞标志物CD44和CD90，认为PSC在软骨诱导条件下能增殖分化为软骨细胞，并分泌大量胞外基质；皮下注射PSC能形成＞2 cm的弹性软骨，重建组织由软骨和软骨膜组成，即使10个月后仍然没有任何异位组织形成，进一步确认软骨膜中存在软骨干／祖细胞。

5 关节软骨表层干细胞

成熟的关节软骨包括表层、中层（移行层）、深层（放射层）及钙化软骨层。表层软骨细胞主要分泌蛋白聚糖4（PRG4），又称润滑素，起到关节润滑作用［18］。Kozhemyakina 等［19］构 建 Prg4GFPCreERt2∶Rosa26floxlacZ转基因小鼠示踪不同年龄阶段Prg4阳性细胞在关节软骨的表达情况，发现胚胎期17.5 d（E17.5）标记的Prg4阳性细胞（注射他莫昔芬后，lacZ染色呈蓝色）在关节软骨表层区域，成年小鼠中Prg4阳性细胞的子代细胞存在于所有关节软骨层，以柱状克隆形式从关节浅表区到潮线下钙化软骨；1月龄标记的Prg4阳性细胞（注射他莫昔芬后，lacZ染色呈蓝色）的子代细胞从关节浅表层延伸到关节软骨的2／3区域。这表明关节软骨细胞深处及潮线以下被标记为Prg4阳性的细胞是E17.5标记为Prg4阳性细胞的子代细胞，而不是1月龄被标记的Prg4阳性细胞的子代细胞。Li等［20］利用 H2BGFP和Prg4-CreErt∶Confetti小鼠研究关节软骨表层干细胞（ACSC），发现表层细胞具有增殖活性，但分裂能力较低；Prg4阳性细胞可沿着关节表面对称分裂，子细胞均留在表层，也可垂直于关节表面非对称分裂，1个子细胞留在表面，另1个向下分化为更深层的软骨细胞，进一步提示这群细胞具有干细胞特性。该研究团队进一步分离这群细胞，发现间充质干细胞表面标志物为阳性，且具有体外克隆形成能力和成软骨、成骨及成脂分化能力。

关节软骨表层细胞具有独特的结构和生物力学特征，关节软骨自我修复能力差可能与ACSC丢失有关［21-22］。Jia等［23］研究发现，表皮生长因子受体（EGFR）信号通路在维持ACSC数目中发挥重要作用，EGFR敲除小鼠ACSC数目明显减少，关节软骨退变加快。体外分化实验证实，ACSC能分化为软骨细胞，且可以迁移至软骨损伤部位进行软骨修复［24］，但具体机制尚不清楚。Yasuhara等［25］采用纤连蛋白黏附法从新生小鼠关节软骨分离ACSC并进行培养，结果发现相比软骨细胞在低密度培养时呈规则的多边形及融合时呈铺路石样的形态特性，经纤连蛋白黏附法分选出的ACSC形态偏长，类似成纤维细胞；逆转录定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测显示，ACSC分化的软骨细胞显著低水平表达间充质干细胞标志物CD73、CD90、CD105和软骨表层标志物Prg4、Erg、Ten C，但显著高水平表达软骨细胞标志物Col2、Acan、Mat-1。Tong等［26］研究证实，在正常关节和OA关节软骨表层存在ACSC。OA早期，ACSC激活并通过增殖反应展现自我修复能力；体外实验显示，白细胞介素（IL）-1β通过激活核因子（NF）-κB显著抑制 ACSC的软骨形成能力，而抑制NF-κB信号通路可促进ACSC软骨形成；SD大鼠OA模型实验证实，抑制NF-κB信号通路可激活ACSC，从而促进软骨再生，证明诱导内源性干／祖细胞用于关节软骨修复和OA治疗的可行性。

颞下颌关节是一种特殊的软骨组织，与膝关节透明软骨不同，属于纤维软骨。2016年，Embree等［27］从颞下颌关节髁突表层分离细胞进行体内异种移植，发现该群细胞不仅能形成软骨和骨，也能形成造血微环境，首次证明颞下颌关节髁突表层存在纤维软骨干细胞；进一步研究发现，降低 Wnt信号可以显著减少大鼠颞下颌ACSC，进而导致关节软骨退变和OA发生。

6 结语

作为软骨组织工程必要因素之一的种子细胞，关节软骨干／祖细胞数量有限，需要体外扩增获得一定数量后予以应用。大量研究或通过在培养基中添加TGF-β、BMP等促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达，或利用成熟软骨细胞形成的共培养微环境、干细胞分泌的细胞因子促进细胞增殖和基质合成。反之，细胞因子又可诱导干细胞分化，防止体外培养条件下软骨细胞去分化［28-30］。然而，对传代30次的软骨干细胞进行细胞生物学分析，发现有1／6的细胞克隆显示出异常核型［31］，提示软骨干细胞在进行临床治疗前应对生物安全性进行多方面验证。随着研究的深入，对关节软骨干／祖细胞的了解将更加全面和深刻，相信在不久的将来，关节软骨干／祖细胞将被广泛应用于软骨组织工程移植重建创伤或疾病引起的关节表面大面积缺损。